專利名稱：用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特別是通過(guò)雜交來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)核酸片段的裝置和 方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種擴(kuò)增特定核酸片段的方法。所述 方法經(jīng)常在研究和診斷包括許多傳染病的各種疾病中使用。擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)可以通過(guò)雜交到固定的互補(bǔ)核酸序列來(lái)達(dá)成。通過(guò)固 定特定互補(bǔ)序列(所謂的捕獲探針)在限定圖案內(nèi)，可以同時(shí)檢測(cè)多 個(gè)核苷酸序列。這種圖案化的捕獲探針陣列經(jīng)常稱為微陣列。雜交到 所述微陣列的核酸序列可以通過(guò)光學(xué)手段例如通過(guò)熒光來(lái)檢測(cè)。
WO-A-01/45843披露了 一種用于執(zhí)行雜交測(cè)定的系統(tǒng)，所述系統(tǒng) 包括用于容納流通裝置的盒。所述流通裝置具有微溝道通道的陣列。 所述盒可包括觀察窗。盡管這個(gè)系統(tǒng)可以在專門的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中工作， 但它不滿足對(duì)于可在護(hù)理點(diǎn)操作的簡(jiǎn)單操作裝置的要求。
WO-A-00/12675披露了 一種被描述為操作容易且不受污染的獨(dú)立 式裝置。所描迷的思想允許使用獨(dú)立式裝置來(lái)快速和精確地檢測(cè)擴(kuò)增 的核酸。所述裝置將核酸提取、特定目標(biāo)擴(kuò)增及檢測(cè)集成到單一裝置 中，允許快速和精確的核酸序列檢測(cè)。所述獨(dú)立式裝置包括第一中 空柱體，具有單封閉端且其中具有多個(gè)腔室；第二中空拉長(zhǎng)柱體，能 夠相對(duì)旋轉(zhuǎn)地接觸地置于所述第一柱體的內(nèi)部。樣品被引入到所述第 一柱體以供提取。所提取的核酸結(jié)合到固相，因此不會(huì)通過(guò)洗滌緩沖 劑的添加而從固相洗脫。擴(kuò)增和標(biāo)記發(fā)生于同一柱體內(nèi)。最后，經(jīng)標(biāo) 記和擴(kuò)增的產(chǎn)物與和受體特定配體共軛的微顆粒反應(yīng)，用于檢測(cè)所述 目標(biāo)序列。
本發(fā)明的目的是提供一種用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的備選簡(jiǎn)單系統(tǒng)。 發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明涉及一種用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的裝置，包括管(1)，
所述管包括含有反應(yīng)成份的至少一個(gè)隔室(3 )，且所述管包括軍(2 )， 其中所述罩包括罩內(nèi)部上的核酸微陣列。
本發(fā)明還涉及一種用于實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸與捕獲探針的雜交的方法， 所述方法包括以下步驟
a) 給送樣品到本發(fā)明所述裝置的底部隔室，所述樣品包括PCR 主混合物、合適的PCR引物以及模板DNA;
b) 給送雜交緩沖劑到隔室(3);
c) 使用革封閉所述裝置，所述罩包括革內(nèi)部上的稱為捕獲探針的 核酸微陣列；
d) 實(shí)施用于擴(kuò)增模板DNA的PCR反應(yīng)；
e) 扭轉(zhuǎn)所述裝置，使得隔室(3)的內(nèi)容流出所述隔室；
f) 可選地反復(fù)扭轉(zhuǎn)所述裝置以確保隔室(3)的內(nèi)容與所述裝置的 內(nèi)容混合；
g) 使擴(kuò)增的模板DNA與所述捕獲探針雜交；以及
h) 檢測(cè)經(jīng)雜交的擴(kuò)增的模板DNA。
在另一示例中，本發(fā)明涉及一種用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的系統(tǒng)，所 述系統(tǒng)包括至少一個(gè)優(yōu)選地多個(gè)如上所述的裝置。


圖l示出本發(fā)明的裝置。 圖2示出本發(fā)明的系統(tǒng)。 圖3說(shuō)明本發(fā)明的方法。
具體實(shí)施方式
定義
模板DNA為存在于樣品中且其存在待檢測(cè)的DNA。
PCR主混合物為PCR反應(yīng)成份的濃縮混合物。這種混合物通常包 括選自聚合酶、緩沖劑、核苷酸或其組合的成份。
微陣列定義為用于測(cè)試核苷酸片段、優(yōu)選地DNA片段的微型化學(xué) 反應(yīng)區(qū)域的集合。
管包括含有試劑的隔室(3)，所述試劑可以在特定反應(yīng)階段，優(yōu)選地在管(1 )底部的樣品中存在的任一 目標(biāo)序列的擴(kuò)增之后，與管(1 ) 底部隔室中存在的成份混合。
至少一個(gè)隔室(3)優(yōu)選地用反應(yīng)成份填充，對(duì)于實(shí)施PCR反應(yīng) 的情形，所述反應(yīng)成份最優(yōu)選地為雜交緩沖劑。
隔室(3)優(yōu)選地在頂側(cè)包括開(kāi)口.按照這種方式，隔室可以被操 縱，使得其內(nèi)容釋放到管(1)中。這種操縱例如可以通過(guò)將裝置/管轉(zhuǎn) 動(dòng)180度來(lái)進(jìn)行。
備選地，隔室(3)由特定材料制成，該特定材料可制成滲透性的 或者可以通過(guò)特定觸發(fā)而破裂。這種觸發(fā)可以是溫度變化、特定波長(zhǎng) 光的應(yīng)用或者被致使在管(l)內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。最優(yōu)選地，隔室(3) 如上所述在其頂側(cè)具有開(kāi)口。
本發(fā)明的裝置優(yōu)選地集成到包括加熱元件(4 )、讀取器(5 )和透 明底板(6)的系統(tǒng)。
這種用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的系統(tǒng)優(yōu)選地包括至少一個(gè)更優(yōu)選地多 個(gè)本發(fā)明的裝置。
為了實(shí)施PCR反應(yīng)，所述系統(tǒng)優(yōu)選地包括加熱元件(4)和讀取 器(5)。
所述系統(tǒng)優(yōu)選地還包括用于旋轉(zhuǎn)所述一個(gè)或多個(gè)裝置的轉(zhuǎn)動(dòng)元件。
優(yōu)選地，讀取器包括CCD相機(jī)。 為了便于檢測(cè)，所述系統(tǒng)最優(yōu)選地包括透明底板。 另一方面，本發(fā)明涉及一種用于實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸與捕獲探針的雜交 的方法，所述方法包括步驟
a) 給送樣品到如上所述裝置的底部隔室，所述樣品包括PCR主 混合物、合適的PCR引物以及模板核酸，優(yōu)選地DNA;
b) 給送雜交緩沖劑到隔室(3);
c) 使用罩封閉所述裝置，所述罩包括罩內(nèi)部上的稱為捕獲探針的 核酸微陣列；
d) 實(shí)施用于擴(kuò)增模板核酸的PCR反應(yīng)；
e) 扭轉(zhuǎn)所述裝置，使得隔室(3)的內(nèi)容流出所述隔室；
f) 可選地反復(fù)扭轉(zhuǎn)所述裝置以確保隔室(3)的內(nèi)容與所述裝置的 內(nèi)容混合；g) 使擴(kuò)增的模板核酸與所述捕獲探針雜交；
h) 檢測(cè)經(jīng)雜交的擴(kuò)增的模板核酸。
在所述方法中，優(yōu)選地使用掃描讀取器，最優(yōu)選地使用CCD相機(jī) 來(lái)實(shí)施檢測(cè)。
本發(fā)明通過(guò)下述第一實(shí)施例予以說(shuō)明。
圖l示出反應(yīng)管的示意照片。包括PCR主混合物、合適的(標(biāo)記 的)PCR引物以及模板DNA的樣品被給送到管(1)的底部。雜交緩 沖劑給送到管(1)內(nèi)部的打開(kāi)的流體隔室(3)。管被罩(2)軍住， 所述罩(2)包括其內(nèi)部上的核酸微陣列。
管(1)置于在此稱為系統(tǒng)(8)的集成讀取器裝置(圖2)中。所 述系統(tǒng)包括能夠(快速)熱循環(huán)的可移動(dòng)加熱塊(加熱元件4)、受熱 頂蓋以及透明的底板(6)。共焦光學(xué)讀取器(5)置于所述底板下。所 述加熱元件可用于熱循環(huán)中的溫度調(diào)節(jié)、等溫?cái)U(kuò)增或者在雜交期間用 于樣品加熱。
在要分析樣品時(shí)，將樣品給送到上述管并且隨后置于加熱塊(4) 內(nèi)(圖3.1)。所述圖示出能夠保持多個(gè)管的加熱塊的示例。用于單個(gè) 管的裝置也是可行的。具有管的加熱塊(4)向上移動(dòng)，以確保管的罩 壓縮到受熱蓋(3.2)。所述蓋保持在略高于100'C的恒定溫度，以防止 PCR熱循環(huán)期間樣品蒸發(fā)。在熱循環(huán)完成之后，加熱塊向下移動(dòng)并扭 轉(zhuǎn)180。 (3.3)。這導(dǎo)致流體流到管的頂部并且雜交緩沖劑流出其隔室 (3)?？蛇x地，加熱塊可反復(fù)扭轉(zhuǎn)以確保PCR流體與雜交緩沖劑的恰 當(dāng)混合?？蛇x地，加熱塊可以直立并再次向上移動(dòng)以用于95'C的變性 步驟。當(dāng)管倒置時(shí)，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物被允許雜交到微陣列上的捕獲探 針。加熱塊向下移動(dòng)到透明板。能夠檢測(cè)焚光的共焦讀取器位于所述 板下。由于讀取器是共焦的，測(cè)量(檢測(cè)和激勵(lì))體積顯著減小到通 常與微陣列表面相距幾微米，且因此讀取器具有增強(qiáng)的表面特異性。 表面特異性增強(qiáng)的結(jié)果為，因?yàn)闊o(wú)需清洗或去除流體，可以實(shí)時(shí)地測(cè) 量雜交。這在圖3.4中予以說(shuō)明。讀取器可以是掃描讀取器。
作為用于增強(qiáng)表面特異性的備選方法，人們可以使用隱失激勵(lì)方 法，其中隱失波在基板表面被激勵(lì)并激勵(lì)表面結(jié)合熒光基團(tuán)。在本語(yǔ) 境中，置于軍的內(nèi)側(cè)的罩表面為基板。
作為第一方法，可以利用基板/流體界面的全內(nèi)反射(TIR)，這導(dǎo)致陣列表面的100至500nm內(nèi)的測(cè)量(激勵(lì))體積。然而TIR優(yōu)選使 用連接到基板的玻璃棱鏡或者使用楔形基板，以使得角度大于基板-流體界面的臨界角的激勵(lì)光耦合到基板內(nèi)。
作為第二優(yōu)選方法，可以使用諸如金屬的不透明成份來(lái)覆蓋基板 并且使用孔徑(的陣列)來(lái)圖案化基板，其中孔徑在與基板-流體界 面平行的平面內(nèi)具有至少一個(gè)維度小于光在所述流體中的衍射極限。 作為示例，可以使用線柵來(lái)圖案化基板，所述線柵的一個(gè)面內(nèi)維度大 于且另一維度小于光在所述流體中的衍射極限。這形成陣列表面的 50nm (通常20至30nm )內(nèi)的激勵(lì)體積。[對(duì)于隱失激勵(lì)這個(gè)方法優(yōu) 于第一方法之處在于，這個(gè)方法更為簡(jiǎn)單-因?yàn)闊o(wú)需棱鏡或楔形表面 且對(duì)于入射角和激勵(lì)點(diǎn)形狀沒(méi)有特別要求并且可以使用簡(jiǎn)單的CCD相
機(jī)來(lái)對(duì)熒光成像-并實(shí)現(xiàn)顯著更小的激勵(lì)體積。
在基板使用線柵來(lái)圖案化的實(shí)施例中，核苷酸陣列理想地可以置 于線柵的開(kāi)口中。
對(duì)于更多檢測(cè)技術(shù)，例如可參考通過(guò)引用結(jié)合于此的國(guó)際申請(qǐng) IB2005/053168。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的裝置，包括管(1)，所述管包括含有反應(yīng)成份的至少一個(gè)隔室(3)，且所述管包括罩(2)，其中所述罩包括罩內(nèi)部上的核酸微陣列。
2. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述至少一個(gè)隔室(3)用反 應(yīng)成份填充，所述反應(yīng)成份為雜交緩沖劑。
3. 如權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的裝置，其中所述隔室(3) 可被操縱使得所述隔室的內(nèi)容釋放到所述管(1)中。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的裝置，其中所述隔室(3) 在隔室頂側(cè)包括開(kāi)口。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的裝置，所述裝置集成到包括 加熱元件(4)、讀取器(5)和透明底板(6)的系統(tǒng)。
6. 用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的系統(tǒng)，包括至少一個(gè)優(yōu)選地多個(gè)如權(quán)利 要求1至4中任一項(xiàng)所述的裝置。
7. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，還包括加熱元件(4)和讀取器(5)。
8. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，還包括用于旋轉(zhuǎn)所述一個(gè)或多個(gè)裝 置的轉(zhuǎn)動(dòng)元件。
9. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其中所述讀取器為共焦讀取器。
10. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，包括作為基板的所述罩的表面， 其中所述基板為楔形，從而允許在所述微陣列表面激勵(lì)熒光基團(tuán)。
11. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，包括作為基板的所述罩的表面， 其中所述基板附著到棱鏡，從而允許在所述陣列表面激勵(lì)熒光基團(tuán)。
12. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，包括作為基板的所述罩的表面， 其中所述基板在面向所述流體的界面覆蓋有圖案化成份，從而允許在 所述陣列表面隱失激勵(lì)熒光基團(tuán)。
13. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，還包括透明底板。
14. 用于實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸與捕獲探針的雜交的方法，所述方法包括 以下步驟a) 給送樣品到如權(quán)利要求l所述的裝置的底部隔室，所述樣品包 括PCR主混合物、合適的PCR引物以及模板核酸，優(yōu)選地DNA;b) 給送雜交緩沖劑到隔室(3);C)使用罩封閉所述裝置，所述罩包括罩內(nèi)部上的稱為捕獲探針的核酸微陣列；d) 實(shí)施用于擴(kuò)增模板核酸的PCR反應(yīng)；e) 扭轉(zhuǎn)所述裝置，使得隔室(3)的內(nèi)容流出所述隔室；f) 可選地反復(fù)扭轉(zhuǎn)所述裝置以確保隔室(3)的內(nèi)容與所述裝置的 內(nèi)容混合；g) 使擴(kuò)增的模板核酸與所述捕獲探針雜交；以及h) 檢測(cè)經(jīng)雜交的擴(kuò)增的模板核酸。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中使用掃描讀取器實(shí)施檢測(cè)。
16. 如權(quán)利要求14所述的方法在傳染病檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
提供了一種適用于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的裝置。所述裝置包括樣品管，所述樣品管包括優(yōu)選地在頂部開(kāi)放的隔室(3)，使得當(dāng)所述管(3)旋轉(zhuǎn)倒置時(shí)其內(nèi)容流出。所述管還包括罩(2)，所述罩包括核酸微陣列，擴(kuò)增的樣品DNA可雜交到所述核酸微陣列。
文檔編號(hào)B01L3/00GK101528351SQ200780038758
公開(kāi)日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2007年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月17日
發(fā)明者D·J·W·克倫德, E·R·沃塞納爾 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司