專利名稱：一種分離提取層析柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域用的器材，特別是涉及一種分離提取層析柱。
背景技術(shù)：
將單一蛋白從組織提取液或蛋白混雜的溶液中純化出來需要經(jīng)歷一系列很復(fù)雜和繁瑣的分離提取過程，耗費時間長而最終收率卻很低。隨著生化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)一種操作簡便、分離特異性高的分離純化生物大分子的方法——親和層析法。它的原理是利用生物大分子之間的特異性吸附或結(jié)合的特性來達到快速純化目標(biāo)蛋白的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要為從事生物醫(yī)學(xué)研究和制備生物制劑的人員提供出一種能夠方便快捷地從雜蛋白溶液中分離純化出熱休克蛋白(HSP)，特別是純化出熱體克蛋白-多肽復(fù)合體(Heat shock protein peptidecomplexes，簡稱HSPPC)的層析柱。
HSP的一個非常重要的生物學(xué)特性是能夠捕捉機體組織和細胞中發(fā)生變異的多肽和蛋白，或入侵病原體所攜帶的外源分子群作為抗原形成HSPPC，HSPPC將它們捕捉到的多肽抗原分子群遞呈給T淋巴細胞，激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)識別和清除變異的自身蛋白和外源的分子和細胞。
由于HSP的N端具有ATP酶的功能，因此它除能與ATP(Adenosinetriphosphate，縮寫ATP，中文稱三磷酸腺苷)作用外，還能特異性地與固相樹脂上偶聯(lián)的ADP(Adenosine 3’，5’diphosphate縮寫ADP，中文稱二磷酸腺苷)相親合。HSPPC如與ATP作用，HSPPC中的多肽分子群就會從HSPPC中被解離出來，HSP的抗原遞呈功能就會喪失。試驗發(fā)現(xiàn)HSPPC與ADP結(jié)合則不發(fā)生解離。因此根據(jù)這個特點和實際需求，采用把ADP偶聯(lián)到固相Agarose樹脂上，當(dāng)含有HSP或HSPPC的雜蛋白溶液流經(jīng)層析柱內(nèi)的ADP-Agarose樹脂時，雜蛋白溶液中的HSP或HSPPC與固相樹脂上的ADP發(fā)生親和作用，因此HSP和HSPPC被吸附滯留在固相樹脂上，而與ADP不發(fā)生親和作用的其它雜蛋白則流過樹脂不會被吸附在樹脂上。ADP-Agarose層析柱不僅能方便快捷地從雜蛋白溶液中分離純化出HSP，而且還能分離純化出HSPPC。
本發(fā)明涉及的是制備一種“分離提取層析柱”，它的特征是由層析柱和ADP-Agarose樹脂兩部分組成，其中，層析柱是由中空型的管狀物1和下端內(nèi)置的篩板2制成，篩板的目的是允許溶液流過但防止樹脂流失。篩板也可由尼龍網(wǎng)篩、陶瓷板、玻璃纖維等可達到相同功能的其它材料替代。層析柱的下端是溶液流出口3，可套接軟膠管。
將Adenosine3’，5’-diphosphate-Agasoe樹脂，簡稱ADP-Agarose樹脂4填充入層析柱內(nèi)即組成分離提取層析柱。
根據(jù)層析柱的大小和填充樹脂的多少可制備出大批量、各種規(guī)格的商品型ADP-Agarose分離提取層析柱。本分離提取層析柱的應(yīng)用可以大幅度地減輕生物學(xué)和醫(yī)學(xué)實驗室純化HSP或HSPPC的勞動強度和縮短純化過程。
熱休克蛋白是一類同源性極高、序列非常保守的存在于細胞內(nèi)的家族蛋白，根據(jù)其分子大小和結(jié)構(gòu)特性可分為多個成員，如HSP-27、HSP-40、HSP-60、HSP-70、HSP-90、HSP-110等蛋白主要存在于胞漿內(nèi)，gp96蛋白主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。它們平時處于低水平的表達狀態(tài)，一旦細胞出現(xiàn)生理性、病理性或環(huán)境的突發(fā)性變化時HSP的表達便會急劇提高，因此熱休克蛋白又被稱為“應(yīng)激蛋白”。HSP通過參與蛋白質(zhì)的結(jié)合、折疊、亞單位的裝配、跨膜轉(zhuǎn)運及抗原遞呈對細胞的生長、分化、基因轉(zhuǎn)錄和自我保護發(fā)揮重要作用。HSP的另一個重要特性是其具有結(jié)合入侵機體內(nèi)部的外源病原體及機體內(nèi)源細胞變異蛋白質(zhì)和多肽的能力。它們與外源蛋白和多肽、內(nèi)源變異蛋白和多肽分子群結(jié)合，形成HSPPC參與抗原遞呈而其HSP本身并不產(chǎn)生抗原性，因此HSP又被稱為“分子伴侶”。制備出一種能使生物學(xué)實驗室和臨床醫(yī)學(xué)實驗室快速、便捷和高效的分離純化出HSP或HSPPC的層析柱在實際應(yīng)用中有著迫切的需求和十分重要的意義。
應(yīng)用者可根據(jù)各自實驗室的條件、提取經(jīng)驗而調(diào)整提取條件而不必拘限于本發(fā)明所敘述的實驗條件。


圖1是本實用新型結(jié)構(gòu)示意圖。
①、②和③為層析柱的結(jié)構(gòu)，②為阻隔樹脂的篩板，③為層析柱的溶液流出口。
④為層析柱內(nèi)裝載的樹脂填料。
具體實施方式
實施例11.組裝層析柱
(1)、Adenosine 3’，5’diphosphate-Agarose樹脂(ADP-Agarose樹脂)可從Sigma公司訂購。
(2)、選用塑料或玻璃制造的層析用空柱。柱的規(guī)格不限，常用的有1×5cm、1.5×10cm、2×20cm等，可根據(jù)實際需求選用并批量制備，如可制備出裝填有5ml、10ml、15ml等不同容量的ADP-Agarose樹脂層析柱。
(3)、平衡液(20mM Tris-Acetate，20mM NaCl，，3mM MgCl2，0.5mMPMSF，15mMβ-mercaptoethanol，pH7.5)。
使用沖洗干凈并干燥的層析用空柱。將平衡液充分浸泡過的ADP-Agarose樹脂用吸管將樹脂與平衡液一起灌裝入層析柱中。使得樹脂在空柱中自然沉降，直至所需容積，柱床中不得留有氣泡。
柱的包裝將灌裝完畢的層析柱兩端用封口膜密封以防止樹脂干燥和污染。將封閉好的層析柱裝入鋁塑包裝袋內(nèi)封口后連同使用說明書一并放入包裝盒中。
2、組織液的制備從大鼠身上取出大約1cm3的腫瘤塊，用生理鹽水沖洗去除血污，修去正常組織，將切割成小碎塊的腫瘤組織放入-20℃冰箱中冷凍2小時后將其置入勻漿器中。向勻漿器中加入適量預(yù)冷的研磨緩沖液(10mM NaHCO3，0.5mMPMSM，pH7.5)研磨。研磨后的組織勻漿液經(jīng)過冷凍離心機8000rpm 10分鐘離心后取其上清液過ADP-Agarose分離提取層析柱。
層析反應(yīng)除特別提示，整個操作過程推薦在4℃環(huán)境中進行。將拆封后取出的成品ADP-Agarose分離提取層析柱用平衡液稍做平衡，取離心后的大鼠腫瘤組織勻漿上清液與等體積的平衡液相混合直接加到ADP-Agarose層析柱上。為使勻漿上清液中的HSPPC與樹脂偶聯(lián)的ADP充分親和，柱流控制在3ml/小時直至勻漿上清液全部進入柱床。
洗滌使用20倍柱床體積的含有0.5M NaCl的平衡液沖洗層析柱，柱流控制在大約1ml/分鐘，然后使用平衡液充分洗滌層析柱直至流出液的紫外監(jiān)測值穩(wěn)定在OD280＜0.02，達到將柱中所有雜蛋白充分去除的目的。
洗脫將層析柱移至常規(guī)室溫下，用洗脫液(含有3mM ADP的平衡液)浸泡柱內(nèi)樹脂30分鐘，然后用5倍柱床體積的洗脫液洗脫與ADP分離的HSPPC。在紫外監(jiān)測下收集峰內(nèi)的流出液。
再次分離洗脫下的HSPPC如果體積過大需要濃縮。使用高壓液相色譜儀(HPLC)進行再次分離，將HSPPC與游離的ADP分子和少量的其它未被去除的雜蛋白分離開來。收集HSPPC所在峰的流出液，經(jīng)過幾次HPLC的分離可得到純度90％以上的HSPPC。
分離物的鑒定利用親和層析的方法純化出的HSPPC蛋白可用高效液相色譜(HPLC)或聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析洗脫產(chǎn)物的純度?？捎米贤夥止夤舛确ㄗ龅鞍缀康臏y定。采用SDS-PAGE電泳和免疫印跡試驗達到蛋白定性的目的。
3、細胞液的預(yù)處理將人的腫瘤細胞株Hella細胞從培養(yǎng)皿上刮離連同培養(yǎng)液收集到離心管中，5000rpm/min離心10分鐘。棄去上清液，將沉淀的細胞用平衡液溫和地沖散并輕輕地沖洗然后再次離心取沉淀。收集大約濕重1克左右的細胞沉淀。
沉淀下的細胞移至塑料試管再加入5ml預(yù)冷的平衡液沖散并懸浮細胞，然后做細胞超聲破碎。離心取上清液過層析柱。
層析反應(yīng)在4℃環(huán)境中將細胞破碎上清液加到平衡好的ADP-Agarose分離提取層析柱上，柱的流速控制在大約2ml/小時。當(dāng)上清液進入柱床與樹脂充分反應(yīng)后，先用含有0.5M NaCl的平衡液100ml沖洗層析柱，然后再用大量平衡液沖洗直至流出液的紫外監(jiān)測吸收值穩(wěn)定在OD280＜0.02。
洗脫采用競爭替代的方式洗脫與樹脂偶聯(lián)的ADP具有親和力的HSPPC。在室溫下用洗脫液(含有3mM ADP的平衡液)浸泡層析柱內(nèi)的樹脂30分鐘，使得HSPPC與固相樹脂偶聯(lián)的ADP分離。再用5倍柱床體積的洗脫液洗脫，在紫外監(jiān)測下收集峰內(nèi)流出液。
再次分離將洗脫收集到的峰內(nèi)流出液置于透析袋內(nèi)，在4℃環(huán)境下對預(yù)冷的HPLC樣品緩沖液透析3次。將透析過的溶液濃縮后用HPLC分離HSPPC和游離的ADP等成分，分離和收集HSPPC峰內(nèi)流出液并做蛋白的定量和定性鑒定。
保存分離出來的HSPPC蛋白經(jīng)冷凍干燥后可放置在-20℃冰箱內(nèi)保存1年不影響其生物學(xué)活性。
分離物的鑒定分離純化出的HSPPC可采用SDS-PAGE凝膠電泳、高效液相色譜(HPLC)和紫外分光等方法做蛋白純度和定量的檢測。采用免疫印跡法(Western Blot)做蛋白定性試驗。
權(quán)利要求1.一種分離提取層析柱，其特征在于，它是由層析柱和在柱內(nèi)填充的二磷酸腺苷-瓊脂糖樹脂兩部分組合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離提取層析柱，其特征在于，所述層析柱是一種中空型管狀物，其一端底部內(nèi)置有允許溶液通過但阻止樹脂顆粒流失的篩板。
專利摘要一種分離提取層析柱，它是由層析柱和在柱內(nèi)填充的二磷酸腺苷樹脂兩部分組合而成。層析柱是一種中空型管狀物，其一端底部內(nèi)置有允許溶液通過但阻止樹脂顆粒流失的篩板。層析柱內(nèi)填充有功能性填料二磷酸腺苷樹脂。本實用新型可從生物組織、細胞勻漿液和其它雜蛋白混合液中快速、簡便、高效地提取出熱休克蛋白家族中的蛋白及與HSP非共價結(jié)合的多肽分子群所形成的熱休克蛋白－多肽復(fù)合體。
文檔編號B01D15/08GK2722998SQ200420007590
公開日2005年9月7日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月31日
發(fā)明者韓蘇, 許佐良, 張傳宇 申請人:北京中天康泰生物科技有限公司