本發(fā)明涉及藻類植物的培養(yǎng)廢液處理及循環(huán)利用方法，特別是涉及鹽藻高密度培養(yǎng)廢液中有益多糖、甘油的提取方法和廢液重復(fù)利用的方法。

背景技術(shù)：

杜氏鹽藻，又稱鹽藻，是一種無細胞壁、有鞭毛的單細胞藻類，并且是最能耐受高鹽的真核生物之一。因鹽藻培養(yǎng)時所需的鹽濃度比較高，所以培養(yǎng)廢液中殘余的鹽濃度較高而不能隨意排放。并且廢液中含有較多的胞外多糖和甘油等高附加值產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物有比較高的經(jīng)濟價值，直接被排放掉，造成資源浪費。因此探尋一種鹽藻培養(yǎng)廢液的高附加值處理方法具有重要的意義。

在中國，鹽藻有很長的培養(yǎng)歷史，因其具有生長速度快、可積累大量的有益代謝產(chǎn)物等特點，使得鹽藻受到人們的關(guān)注。鹽藻在脅迫環(huán)境中(高溫、高鹽和/或高光)可積累大量的β-胡蘿卜素，最多高達藻細胞干重的14％。β-胡蘿卜素能防治癌癥、腫瘤和心血管疾病以及老年癡呆和白內(nèi)障等與年齡有關(guān)的退化性疾?。畸}藻在脅迫環(huán)境中還可積累大量的甘油，含量最高達80％，天然甘油是優(yōu)質(zhì)的化妝品原料，同時也是化工、輕工和醫(yī)藥工業(yè)的重要原料；杜氏藻多糖復(fù)合物具有較強的藥物生物活性，在免疫佐劑活性方面能與完全福氏佐劑相似，能夠明顯的增強抗原性和機體免疫功能、增強機體巨噬細胞的吞噬功能提高機體免疫力、抑制實體瘤細胞的生長，其抑制率高達60％以上。另外，鹽藻細胞能夠大量積累蛋白質(zhì)，含量高達細胞干重的50-60％，其中包括人類必需的氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸，是一種優(yōu)良的蛋白飼料和人類食品加工原料；另外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹽藻和類胡蘿卜素還具有潛在的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化以及預(yù)防脂肪肝等多種藥理活性。因此，鹽藻的大量和高密度培養(yǎng)已經(jīng)引起了研究人員的極大關(guān)注。但是，隨著鹽藻等微藻的大量培養(yǎng)，其培養(yǎng)廢液的處理問題也逐漸突出，如廢液中鹽度較高，隨意排放會造成環(huán)境污染、土壤板結(jié)鹽化、影響動植物的生長，并且造成了資源的浪費、降低了經(jīng)濟效益。如2011年鹽藻培養(yǎng)的鹵水約2萬立方米，也就是2萬立方米污水，如果通過本方法處理，可以節(jié)約60％的水資源。

但是目前用于微藻養(yǎng)殖廢液處理的方法非常少，目前并沒有鹽藻廢液中可溶性多糖、甘油提取方法的相關(guān)專利，經(jīng)查詢，文獻中大多是在收集分離細胞后直接補充培養(yǎng)基用于微藻的培養(yǎng)，通過調(diào)查專利情況如下：

專利(CN2338338)“微藻廢水處理裝置”，該專利提供了一種微藻的培養(yǎng)廢水的處理裝置，其特點是將反應(yīng)器、廢水供入部分、再生液供給部分以及排水放空閥等結(jié)合起來并添加通氣與光照設(shè)施，但是培養(yǎng)液中的甘油、多糖并未處理，使得藻液的粘度增加，影響微藻生長。

在一些文獻中有相關(guān)報道是通過聚丙烯中空纖維膜法收集鹽藻細胞，其分離清液未經(jīng)進一步處理，便添加鹵水繼續(xù)用作鹽藻培養(yǎng)。這種方法的特點是完成了鹽藻廢液的再次利用，但是其中某些元素用量無法確定，養(yǎng)殖效果不好，廢液中的多糖、甘油、蛋白未清除，會使廢液在養(yǎng)殖過程更加容易染雜菌，從而降低效率。

文獻“均勻設(shè)計優(yōu)化鹽藻多糖提取工藝”薛巧如等，提出最適條件為70℃，pH值8，液料比18：1，處理300分鐘，糖得率最高達到7.98％。文獻“鹽藻水溶性多糖的提取與純化”劉云鶴等，鹽藻多糖的提取工藝中指出最適提取溫度是85℃，提取時間300分鐘，液料比20：1，多糖得率13.09％。但是，這兩篇文獻都是基于鹽藻細胞(干粉或者鹽藻泥)的多糖提取方法，適宜于多糖含量較高的實驗，僅可借鑒于鹽藻廢液的蛋白、多糖甘油的去除，并且高溫會導(dǎo)致鹽藻多糖活性的降低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種成本低廉、操作簡單、并能提高鹽藻經(jīng)濟效益、減少污水排放、減少環(huán)境污染、提高資源利用率、節(jié)約資源的綠色環(huán)保的鹽藻廢液的高附加值處理方法。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種鹽藻培養(yǎng)廢液的高附加值處理方法，其特征在于：將鹽藻廢液通過沙濾床過濾、大孔吸附樹脂吸附洗脫，對鹽藻廢液中的鹽藻多糖、甘油進行回收，并且將洗脫廢液進行處理，補加營養(yǎng)可以用于鹽藻的再次培養(yǎng)。

而且，所述大孔吸附樹脂為X-5，處理方法為：取100g大孔樹脂，用500mL蒸餾水充分潤脹24h，之后沸水浴3h充分溶脹，冷卻后濕法裝柱，蒸餾水平衡2-3h。

而且，所述X-5吸附柱特性為：填料量設(shè)計為為7/10-8/10，流速設(shè)置為700L/h-900L/h，處理時間設(shè)置為9-11小時。

而且，所述處理的條件為首先收集細胞，然后將廢液經(jīng)過沙濾，陰性大孔樹脂吸附柱吸附，洗脫，洗脫液收集用作得到鹽藻多糖、甘油等有機物；濾過液補加營養(yǎng)用于鹽藻培養(yǎng)。

而且，沙濾床設(shè)計為粒徑為1.5-3mm，沙粒分布系數(shù)為k(60)-k(80)，厚度為0.6-0.8m，直徑0.2-0.4m，平衡液面高度0.2-0.4m，透過液流速為1000～1500L/h。

而且，所述大孔吸附樹脂吸附洗脫所用溶液鹽濃度為2.5％，pH值為8.5，洗脫溫度為35～40℃，洗脫流速為2000L/h。

而且，所述補加營養(yǎng)時添加微量元素和大量元素，成分如下

微量元素：H₃PO₃61.0mg/L，ZnCl₂4.1mg/L，CoCl₂.6H₂O 5.1mg/L，MnCl₂·4H₂O4.1mg/L，CuSO₄3.6mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 38.0mg/L，F(xiàn)eCl₃·6H₂O 2.5mg/L；

補充大量元素：KCl 0.40g/L，MgSO₄0.80g/L，KNO₃0.50g/L，KH₂PO₄0.04g/L，NaHCO₃0.21g/L，CaCl₂0.02g/L；

而且，具體步驟如下：

⑴廢液的前處理及通過濾柱條件：將廢液經(jīng)過沙濾，沙濾床設(shè)計為砂粒粒徑為1.5～3mm，沙粒分布系數(shù)為k(60)～k(80)，厚度為0.6～0.8m，直徑0.2～0.4m，平衡液面高度0.2～0.4m；

⑵流速設(shè)置為1000～1500L/h，經(jīng)過沙濾處理后的廢液進入大孔樹脂層析柱；

⑶稱取12～18kg大孔樹脂X-5干粉，加入55～70L蒸餾水，浸泡18～20h，然后沸水浴3h使大孔樹脂X-5充分潤脹，待冷卻后沖洗3次，進行減壓脫氣，濕法裝柱，之后用5％鹽酸浸泡1～2h，水洗至中性，而后用2％氫氧化鈉浸泡1～2h，水洗至中性，最后進行吸附；

⑷吸附柱設(shè)計為直徑0.16～0.32m，柱長1.25～1.55m，填料量為柱體7/10～8/10，流速設(shè)置為700～900L/h；

⑸在處理9～11h后，對大孔樹脂X-5吸附柱進行洗脫，洗脫液為pH＝8.5的含有0.15～0.20M氫氧化鈉的0.8～1.2％氯化鈉洗脫，洗脫溫度為35～40℃，洗脫流速為1500～1800L/h，洗脫體積為柱體體積的1.8～3倍，洗脫液用于回收鹽藻胞外多糖、甘油等；

⑹經(jīng)過吸附處理后的濾液，補加營養(yǎng)成分(如下所示)，可繼續(xù)用于鹽藻培養(yǎng)；并確定廢液處理后可重復(fù)利用2～3次。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下：

本發(fā)明將大規(guī)模生產(chǎn)采收完藻體后培養(yǎng)基的處理和回流：采收完藻體的培養(yǎng)基不能直接回流到培養(yǎng)池直接使用，需經(jīng)過沉淀過濾，之后經(jīng)過沙濾、過濾柱分離除去鹽藻分泌的多糖和甘油、蛋白等有機成分后，補加營養(yǎng)元素后方可回流至培養(yǎng)池繼續(xù)使用。

本發(fā)明提供了一種鹽藻培養(yǎng)廢液的高附加值處理方法，該方法中大孔樹脂可以收集鹽藻生長過程中分泌的胞外多糖和甘油，從而提高經(jīng)濟效益，減少培養(yǎng)廢水的排放量，能夠節(jié)約大量水資源，并且可以通過補充營養(yǎng)元素保證鹽藻的生長和繁殖。

本方法能夠獲得鹽藻胞外多糖和鹽藻天然甘油這些高附加值產(chǎn)物，并且減少了鹽藻培養(yǎng)廢水的排放，減輕環(huán)境污染，鹽藻廢水處理后可以重復(fù)利用，節(jié)約了水資源和礦物質(zhì)資源，減少了成本，極大的提高了經(jīng)濟效益。

附圖說明

圖1為本發(fā)明鹽藻培養(yǎng)廢液高附加值處理方法流程圖；

圖2為回收得到的多糖以及甘油樣品圖片，圖2-a為多糖，圖2-b為甘油；

圖3為濾過液的重復(fù)利用次數(shù)對鹽藻生物量的影響圖，圖3-a圖表示細胞數(shù)，圖3-b圖表示干重；

圖4為濾過液的不同利用次數(shù)對鹽藻類胡蘿卜素積累的影響圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明將鹽藻培養(yǎng)廢液經(jīng)過沙濾，X-5大孔樹脂吸附，洗脫收集得到鹽藻胞外多糖、甘油等，濾過液通過補充營養(yǎng)成分可重復(fù)利用，回收提取鹽藻胞外多糖以及甘油，并回收得到鹽藻胞外多糖8.59mg/L，甘油2.87mg/L，回收效率分別為11.6％和7.8％。濾過液中多糖、甘油、蛋白質(zhì)殘留量的殘留量分別低于未處理廢液的10％、12％、5％。

確定第1次回收的濾過液用作二次培養(yǎng)時有助于鹽藻的生長，濾過液回收利用2到3次后生長促進效果不顯著，與新鮮培養(yǎng)基類似。3次重復(fù)利用后不適宜用于鹽藻培養(yǎng)。

一種鹽藻培養(yǎng)廢液的高附加值處理方法，步驟如下：

⑴廢液的前處理及通過濾柱條件：將廢液經(jīng)過沙濾，沙濾床設(shè)計為砂粒粒徑為1.5～3mm，沙粒分布系數(shù)為k(60)～k(80)，厚度為0.6～0.8m，直徑0.2～0.4m，平衡液面高度0.2～0.4m。

⑵流速設(shè)置為1000～1500L/h，經(jīng)過沙濾處理后的廢液進入大孔樹脂層析柱。

⑶稱取12～18kg大孔樹脂X-5干粉，加入55～70L蒸餾水，浸泡18～20h，然后沸水浴3h使大孔樹脂X-5充分潤脹，待冷卻后沖洗3次，進行減壓脫氣，濕法裝柱，之后用5％鹽酸浸泡1～2h，水洗至中性，而后用2％氫氧化鈉浸泡1～2h，水洗至中性，最后進行吸附。

⑷吸附柱設(shè)計為直徑0.16～0.32m，柱長1.25～1.55m，填料量為柱體7/10～8/10，流速設(shè)置為700～900L/h。

⑸在處理9～11h后，對大孔樹脂X-5吸附柱進行洗脫，洗脫液為pH＝8.5的含有0.15～0.20M氫氧化鈉的0.8～1.2％氯化鈉洗脫，洗脫溫度為35～40℃，洗脫流速為1500～1800L/h，洗脫體積為柱體體積的1.8～3倍，洗脫液用于回收鹽藻胞外多糖、甘油等。

⑹經(jīng)過吸附處理后的濾液，補加營養(yǎng)成分(如下所示)，可繼續(xù)用于鹽藻培養(yǎng)。并確定廢液處理后可重復(fù)利用2～3次。

營養(yǎng)成分中的大量元素(g·L^-1)：

KNO₃ 0.50g；KCl 0.4g；NaHCO₃ 0.21g；KH₂PO₄ 0.04g；NaCl 6.00g；

MgSO₄ 0.80g。

營養(yǎng)成分中的微量元素(mg·L^-1)：

H₃PO₃ 61.0mg；ZnCl₂4.1mg；CoCl₂.6H₂O 5.1mg；MnCl₂·4H₂O 4.1mg；

CuSO₄ 3.6mg；(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 38.0mg；Na₂EDTA·2H₂O 2.09mg；

FeCl₃·6H₂O 2.44mg。

為了確定處理方法的各種參數(shù)，本發(fā)明做如下實施例實驗。

實施例1

不同沙濾條件對過濾結(jié)果的影響

沙濾設(shè)置參數(shù)首先沙子粒徑的選擇范圍是0.5～1.5，1.5～3，3～4.5mm，沙濾厚度為0.7m，確定1.5～3.5mm的沙濾濾液無固體懸浮顆粒；流速設(shè)置范圍為200～500L/h，500～1000L/h 1000～1500L/h，1500～2000L/h，證明1000～1500L/h過濾濾液澄清，放置后無固體沉淀并且效率較高；

實施例2

不同濾柱條件對過濾結(jié)果的影響

⑴設(shè)置填料量比為8/10，流速設(shè)置為500L/h、600L/h、700L/h、800L/h、900L/h、1000L/h，處理5小時，實驗結(jié)果表明：流速為700L/h～900L/h時鹽藻胞外多糖與甘油吸附率分別為89％左右和58％左右，有利于吸附效率；

⑵設(shè)置不同處理時間確定處理量：5～7h、7～9h、9～11h、11～13h，處理時間為9h～11h時，鹽藻多糖以及甘油的吸附率分別為86％左右和55％左右；

實施例3

不同洗脫條件的確定

⑴在經(jīng)過大孔樹脂X-5吸附柱處理10h后，進行洗脫，洗脫條件設(shè)置氯化鈉濃度為0.5％～1％、1％～2％、2％～3％、3％～4％，在溫度為25℃時，用pH值為7的洗脫液以1500L/h的流速洗脫3h。結(jié)果證明，鹽濃度為2％～3％時，洗脫率為70％以上；鹽藻胞外多糖以及甘油的得率分別為9.4％和7.6％。

⑵設(shè)定洗脫液pH值范圍分別為pH＝5～6、6～7、7～8、8～9，洗脫鹽濃度為2.5％、溫度為25℃、流速1500L/h洗脫3h，pH值為8時，洗脫率為76％以上；鹽藻胞外多糖以及甘油的回收率分別為9.6％和7.7％。

⑶洗脫溫度設(shè)置范圍為20～25℃，25～30℃、30～35℃、35～40℃、40～45℃、45～50℃，在洗脫鹽濃度為2.5％、pH為8條件下以1500L/h流速洗脫3h；洗脫溫度為35℃～40℃時，洗脫率達到81％，鹽藻多糖與甘油回收率分別為10.5％和7.8％；

⑷流速設(shè)置分別為750L/h、1000L/h、1500L/h、2000L/h、2500L/h、3000L/h，在鹽度為2.5％、溫度40℃、pH為8.5條件下洗脫，洗脫總體積為4500L；當流速為2500L/h時，洗脫率為100％，鹽藻多糖與甘油回收率為11.4％和7.8％；

洗脫條件設(shè)置為鹽濃度2.5％，洗脫液pH值設(shè)置為8，洗脫溫度為38℃，洗脫流速為2500L/h，洗脫時間3小時，鹽藻胞外多糖以及甘油的回收率分別為11.6％和7.8％。

實施例4

不同利用次數(shù)對鹽藻生物量的影響

按照鹽藻培養(yǎng)基配方補加微量元素與大量元素，處理后濾過液分別利用1次～4次4個實驗組，每個實驗組3個平行，每2天測定細胞數(shù)；培養(yǎng)25天后，取200mL藻液，收集細胞，于90℃烘箱烘干5小時，稱量干重；如圖4，第一二次循環(huán)利用有利于鹽藻生長，第三次可以作為培養(yǎng)基使用。

實施例5

鹽藻積累類胡蘿卜素的檢測和β-類胡蘿卜素含量的分析

在培養(yǎng)20天后，收集不同循環(huán)次數(shù)的培養(yǎng)基中的鹽藻細胞，利用丙酮法對鹽藻細胞進行處理后，按照Lichtentaler and Wellburn formus計算鹽藻細胞中類胡蘿卜素的含量。第一次利用時，類胡蘿卜素的積累量為289.4mg/L，第二次為196.7mg/L，當重復(fù)利用第3次時，類胡蘿卜素的積累量為99.1mg/L，而對照組鹽藻積累的類胡蘿卜素只有98.3mg/L，利用3次之后類胡蘿卜素的積累量明顯低于對照組，說明鹽藻培養(yǎng)基在處理之后可以利用2-3次。