本發(fā)明涉及一種檢測湖泊藻類有機(jī)磷的降解方法及應(yīng)用,屬于水資源生態(tài)環(huán)境治理領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

全球水資源短缺的重要原因之一就是水體污染，而湖泊富營養(yǎng)化是水體污染的普遍現(xiàn)象，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)是湖泊富營養(yǎng)化的重要生態(tài)響應(yīng)。磷、氮等營養(yǎng)元素的增加是導(dǎo)致藍(lán)藻暴發(fā)的重要原因。這些營養(yǎng)元素過量積累在湖泊中，將會引起浮游藻類的迅速繁殖，從而形成藍(lán)藻水華暴發(fā)現(xiàn)象。

磷作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)富營養(yǎng)化的限制性主要因素之一，成為目前富營養(yǎng)化研究的重點(diǎn)元素。湖泊中的磷主要分為外源性磷及內(nèi)源性磷，在外源磷輸入得到控制的前提下，內(nèi)源磷作為限制性營養(yǎng)鹽顯著影響湖泊生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)狀態(tài)。內(nèi)源磷的釋放是導(dǎo)致湖泊生態(tài)系統(tǒng)富營養(yǎng)狀態(tài)繼續(xù)惡化的主導(dǎo)因素，而藻類腐爛分解是內(nèi)源營養(yǎng)鹽的重要來源，它們影響湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的各種生物地球化學(xué)過程，主要包括營養(yǎng)循環(huán)、食物鏈過程、溫度、光照、大氣以及各種水文過程中的動態(tài)變化，沉積物的形成以及水體和沉積物界面的氧化還原狀態(tài)等，因此，研究藻類來源磷的地球化學(xué)循環(huán)顯得尤為重要。

湖泊水體中的磷主要有兩種形態(tài)，分別是無機(jī)磷和有機(jī)磷。其中無機(jī)磷極易被水生生物吸收利用，而有機(jī)磷由于自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜且受到表征手段的限制，以往研究多集中于湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的無機(jī)磷分析與探索，對有機(jī)磷的研究相對較為匱乏，僅有的研究也只針對有機(jī)磷的量(即總磷與無機(jī)磷差減后的量)進(jìn)行簡單分析。當(dāng)外源輸入得到一定控制的條件下，藍(lán)藻暴發(fā)過程中為維持自身的生長繁殖將消耗掉湖泊水體中大量的無機(jī)磷，但一般藍(lán)藻暴發(fā)持續(xù)時(shí)間產(chǎn)達(dá)數(shù)個(gè)月，除了沉積物的釋放以外，大量的藻類殘骸腐爛降解產(chǎn)生的有機(jī)物(包括有機(jī)磷、有機(jī)氮、有機(jī)碳等)是否會對藍(lán)藻持續(xù)暴發(fā)提供可以吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì)呢？其中的有機(jī)磷是否能夠快速補(bǔ)充藍(lán)藻二次暴發(fā)所需要的磷源呢？當(dāng)湖泊水體中無機(jī)磷含量降低時(shí)，磷的另外一個(gè)重要形態(tài)——有機(jī)磷將會有哪些降解或轉(zhuǎn)化呢？這是一個(gè)值得深思的問題。但目前現(xiàn)階段對于富營養(yǎng)化湖泊中藍(lán)藻暴發(fā)產(chǎn)生的優(yōu)勢藻類可利用性的分析研究十分匱乏。

富營養(yǎng)化湖泊中廣泛存在著酶等微生物，在這些微生物的作用下，占藻類總磷一半含量的有機(jī)磷是否會在微生物的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化？如果發(fā)生轉(zhuǎn)化，在哪種酶(堿性磷酸酶、磷酸二酯酶、植酸酶等)的作用下轉(zhuǎn)化率最大？轉(zhuǎn)化后的磷可能進(jìn)入湖泊水體中，這些磷是否會增加湖泊水體中的磷濃度或改變湖泊自然環(huán)境？轉(zhuǎn)化的磷是否會有部分容易被生物再次利用？如果可以利用，又對水華再次暴發(fā)起到什么作用？除了藻類殘?bào)w釋放出的磷以外，還有部分不能完全被微生物所分解，那么其余殘?jiān)捉M分的化學(xué)結(jié)構(gòu)又是怎樣的？伴隨著這些未知，因此，在實(shí)驗(yàn)室中控制好外部環(huán)境條件(如pH、溫度等)，添加酶溶液和緩沖溶液同步進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)，分析湖泊藻類殘?bào)w腐爛分解后的降解特征及釋放規(guī)律，這對內(nèi)源磷的循環(huán)機(jī)理探索以及政府對富營養(yǎng)化湖泊的管理與治理具有重要決策意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題提供一種檢測湖泊藻類有機(jī)磷的降解方法及應(yīng)用，本申請以富營養(yǎng)化湖泊限制性營養(yǎng)因子——磷這種營養(yǎng)鹽為切入點(diǎn)，對富營養(yǎng)化湖泊中具有典型代表意義的藻類(微囊藻、小球藻、螺旋藻)進(jìn)行湖泊內(nèi)源負(fù)荷的相關(guān)研究，深入探討藻類對湖泊磷循環(huán)過程所起的重要貢獻(xiàn)，以期為深入理解內(nèi)源污染對富營養(yǎng)化湖泊生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和環(huán)境行為特性提供科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種檢測湖泊藻類有機(jī)磷的降解方法,包括：

1)有機(jī)磷水解酶的組合設(shè)計(jì)

本發(fā)明選擇富營養(yǎng)化湖泊中廣泛存在的三種酶堿性磷酸酶(簡稱APase)、磷酸二酯酶(簡稱PDEase)和植酸酶(簡稱Phytase)作為降解藻類有機(jī)磷的水解酶，由于堿性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶分別水解不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷，使其轉(zhuǎn)化為生物可直接利用的正磷酸鹽，故將三種酶單獨(dú)或組合使用，以達(dá)到表征藻類中的有機(jī)磷形態(tài)、降解特征及其生物可利用性的目的，具體為：

①堿性磷酸酶單獨(dú)使用，水解活性單酯磷及聚合態(tài)磷；

②堿性磷酸酶和磷酸二酯酶組合使用，水解活性單酯磷、二酯磷及聚合態(tài)磷；

③堿性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶組合使用，水解活性單酯磷、二酯磷、植酸磷及聚合態(tài)磷；

其中，②與①相減，得二酯磷的含量，③與②相減，得植酸磷的含量；

2)有機(jī)磷水解酶溶液的配置

所述堿性磷酸酶(編號為EC3.1.3.1)來源于牛腸粘膜，固體粉末的活性為30U/mg；所述磷酸二酯酶(編號EC3.1.4.1)來源于響尾蛇毒液，固體粉末的活性為0.02U/mg；所述植酸酶(編號EC3.1.3.26)來源于小麥，固體粉末的活性為0.03U/mg，上述三種酶均購自美國Sigma公司；

2.1)堿性磷酸酶溶液的配置方法：

取3.33mg堿性磷酸酶固體粉末，用0.1mol/L pH＝9.0的Tris-HCl緩沖溶液定容至100mL,配置成活性為1U/mL的堿性磷酸酶溶液；

2.2)堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合溶液的配置方法：

取10mg磷酸二酯酶固體粉末，用10mL活性為1U/mL的堿性磷酸酶溶液溶解，配置成活性為0.02U/mL的堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合溶液；

2.3)堿性磷酸酶、磷酸二酯酶與植酸酶組合溶液的配置方法：

A)取600mg植酸酶固體粉末，用1mol/L HAc-NaAc溶液定容至100mL，得活性為0.18U/mL的第一植酸酶溶液；

B)取5mL 0.18U/mL的第一植酸酶溶液，加入5mL 0.1mol/L pH＝7.0的Tr is-HCl緩沖溶液，得活性為0.045U/mL的第二植酸酶溶液；

C)取20mg磷酸二酯酶固體粉末，加入10mL 0.045U/mL的第二植酸酶溶液，再加入10mL 1U/mL的堿性磷酸酶溶液，配置成活性為0.06U/mL的堿性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶組合溶液；

上述步驟2.1)-2.3)配置的三種酶溶液均置于4℃冷藏，且冷藏不得超過一星期，否則棄去重配；

3)酶水解實(shí)驗(yàn)

3.1)堿性磷酸酶水解實(shí)驗(yàn)

分別取藻類樣品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL錐形瓶中，設(shè)置對照組和處理組，向?qū)φ战M中添加200mL 0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液和1mL 1mol/L的迭代化納(NaN₃)溶液，向處理組中添加190mL0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液、1mL 1mol/L的NaN₃溶液和10mL 1U/mL的堿性磷酸酶溶液，兩組實(shí)驗(yàn)均放置在20℃恒溫培養(yǎng)箱中150r/min振蕩培養(yǎng)18h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行；

3.2)堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合使用的水解實(shí)驗(yàn)

分別取藻類樣品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL錐形瓶中，設(shè)置對照組和處理組，向?qū)φ战M中添加200mL 0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液和1mL 1mol/L的NaN₃溶液，向處理組中添加190mL 0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液、1mL 1mol/L的NaN₃溶液和10mL 0.02U/mL的堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合溶液，兩組實(shí)驗(yàn)均放置在20℃恒溫培養(yǎng)箱中150r/min振蕩培養(yǎng)18h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行；

3.3)堿性磷酸酶、磷酸二酯酶與植酸酶組合使用的水解實(shí)驗(yàn)

分別取藻類樣品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL錐形瓶中，設(shè)置對照組和處理組，向?qū)φ战M中添加200mL 0.1mol/L pH＝5.15的醋酸-乙酸鈉(HAc-NaAc)緩沖溶液和1mL 1mol/L的NaN₃溶液，向處理組中添加190mL 0.1mol/L pH＝5.15的HAc-NaAc緩沖溶液，1mL 1mol/L的NaN₃溶液，和10mL 0.06U/mL的堿性磷酸酶、磷酸二酯酶與植酸酶組合溶液，兩組實(shí)驗(yàn)均放置在20℃恒溫培養(yǎng)箱中150r/min振蕩培養(yǎng)18h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行；

在上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟中加入NaN₃溶液的目的是抑制細(xì)菌生長。

分別取上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)中對照組和處理組培養(yǎng)后的上清液各10mL，10000r/min離心30min，過0.45μm濾膜，利用磷鉬藍(lán)比色法分別測定處理組酶培養(yǎng)后上清液中的總磷含量TP_處理組和無機(jī)磷含量P_i處理組，對照組培養(yǎng)后上清液中的總磷含量TP_對照組和無機(jī)磷含量P_i對照組，則加酶后上清液中有機(jī)磷P_o水解量＝P_i處理組-P_i對照組，測完上清液中的無機(jī)磷含量P_i后，其余的190mL上清液和殘?jiān)鋬龈稍铮瑸橄乱徊綔y³¹P-NMR做準(zhǔn)備；

4)測液態(tài)³¹P-NMR

向冷干的殘?jiān)屑尤?0mL NaOH與EDTA組成的混合溶液，其中，NaOH的濃度為0.5mo/L，EDTA的濃度為0.25mmol/L，振蕩16h提取殘?jiān)械挠袡C(jī)磷，于10000r/min下離心30min后，0.45μm濾膜過濾，留取殘?jiān)械臑V后液冷干，得殘?jiān)鼮V后液；

把冷干后的上清液和殘?jiān)鼮V后液分別溶解于1mL NaOH與EDTA組成的混合溶液中，其中，NaOH的濃度為1mo/L，EDTA的濃度為0.1mmol/L，超聲振蕩使其充分溶解，離心過濾后，分別測上清液和殘?jiān)鼮V后液中的液態(tài)³¹P-NMR，測試條件和儀器設(shè)置參數(shù)如下：

采用BRUKER標(biāo)準(zhǔn)腔5mm BBO探頭，³¹P的共振頻率為161.98Hz，測定溫度為20℃，譜峰寬度為5Hz，獲取時(shí)間AQ為0.2102s,³¹P-NMR參數(shù)中延遲時(shí)間D₁的設(shè)置為5s，分析測試時(shí)間為15h；

5)計(jì)算

通過步驟4)中得到的波譜進(jìn)行積分及對各磷組分進(jìn)行定性分析，并根據(jù)步驟3)得到的TP含量計(jì)算藻類中各磷組分的含量。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，在3)中，實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿要先用HCl浸泡24h，洗凈后160℃高溫滅菌1h，整個(gè)操作在無菌臺進(jìn)行。

進(jìn)一步，在3)中，采用磷鉬藍(lán)法測定藻類對照組和處理組上清液中的TP時(shí)，需要往測定溶液中添加1mL質(zhì)量濃度為20％的十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)溶液。

十二烷基硫酸鈉溶液的配置：取20g SDS固體粉末，溶解于100mL超純水中，即配置成了質(zhì)量濃度20％的SDS溶液。

采用此步驟的有益效果是防止在測定過程中因?yàn)樗峄a(chǎn)生酶蛋白沉淀等干擾磷的測定。

本發(fā)明還提供一種如上所述的降解方法用于計(jì)算富營養(yǎng)化湖泊中藻類有機(jī)磷的降解量，模擬藻類腐爛分解后在湖泊水體以及沉積物中的降解過程及降解速率，揭示藍(lán)藻循環(huán)往復(fù)暴發(fā)的機(jī)理，同時(shí)對政府管理與治理富營養(yǎng)化湖泊具有指導(dǎo)意義。

在本發(fā)明中，TP代表總磷含量，P_i代表無機(jī)磷含量，P_o代表有機(jī)磷含量。

本發(fā)明藻類選擇依據(jù)：本申請發(fā)明人對滇池、太湖、巢湖、武漢東湖、烏梁素海、洱海、撫仙湖和博斯騰湖等8個(gè)富營養(yǎng)化湖泊中的藻類分布情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)微囊藻、小球藻和螺旋藻廣泛分布于富營養(yǎng)化湖泊中，具有典型性及可研究的價(jià)值。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明用儀器分析(³¹P-NMR)和生物化學(xué)法(酶水解)研究我國富營養(yǎng)湖泊藍(lán)藻水華暴發(fā)的優(yōu)勢藻類有機(jī)磷的組成特征和酶降解特征(即生物有效性)，開展湖泊藻類有機(jī)磷的降解實(shí)驗(yàn)和模擬研究，旨在認(rèn)識富營養(yǎng)化湖泊藍(lán)藻水華暴發(fā)后產(chǎn)生的大量藻類來源的有機(jī)磷再循環(huán)特征，及其認(rèn)識該部分內(nèi)源有機(jī)磷的再循環(huán)是否作為藍(lán)藻水華二次暴發(fā)內(nèi)源磷的重要來源。研究結(jié)果為進(jìn)一步認(rèn)識湖泊有機(jī)磷生物地球化學(xué)循環(huán)提供新的數(shù)據(jù)，并為富營養(yǎng)化湖泊營養(yǎng)鹽的控制提供科學(xué)依據(jù)。

附圖說明

圖1a為APase作用下微囊藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖1b為APase作用下小球藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖1c為APase作用下螺旋藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖2a為APase作用下微囊藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖2b為APase作用下小球藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖2c為APase作用下螺旋藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖3a為APase+PDEase作用下微囊藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖3b為APase+PDEase作用下小球藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖3c為APase+PDEase作用下螺旋藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖4a為APase+PDEase作用下微囊藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖4b為APase+PDEase作用下小球藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖4c為APase+PDEase作用下螺旋藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖5a為APase+PDEase+Phytase作用下微囊藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖5b為APase+PDEase+Phytase作用下小球藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖5c為APase+PDEase+Phytase作用下螺旋藻上清液³¹P-NMR譜圖；

圖6a為APase+PDEase+Phytase作用下微囊藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖6b為APase+PDEase+Phytase作用下小球藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖6c為APase+PDEase+Phytase作用下螺旋藻殘?jiān)?sup>31P-NMR譜圖；

圖7為各種酶作用下藻類有機(jī)磷降解為生物可利用性磷量的估算圖；

圖8為湖泊藻類有機(jī)磷循環(huán)過程示意圖。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

太湖是典型富營養(yǎng)化淺水湖泊，近年來藍(lán)藻水華嚴(yán)重，國務(wù)院將其列入需要重點(diǎn)治理的富營養(yǎng)化水體之一。二十世紀(jì)80年代后期，太湖外源輸入還未得到有效控制，水體中各項(xiàng)指標(biāo)均嚴(yán)重超標(biāo)。直至二十世紀(jì)90年代后期，國家對太湖周邊重點(diǎn)工業(yè)污廢水進(jìn)行嚴(yán)格控制，太湖水體氮、磷等各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)呈現(xiàn)明顯下降趨勢。

但是，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，湖泊內(nèi)源(沉積物、藻類等)中能夠積累大量的營養(yǎng)鹽，在此狀態(tài)下太湖的內(nèi)源磷負(fù)荷本身已經(jīng)十分嚴(yán)重，加之太湖系統(tǒng)內(nèi)擾動的作用，使太湖內(nèi)源營養(yǎng)鹽與水體屢次交換，促進(jìn)藻類的迅猛成長，從而促使水華的迅速暴發(fā)。因此，當(dāng)外源輸入得到控制的前提下，研究內(nèi)源磷的循環(huán)過程對分析湖泊富營養(yǎng)化發(fā)生機(jī)理及探討藍(lán)藻水華再暴發(fā)原因具有重要意義，為有效解決湖泊富營養(yǎng)化問題提供理論科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明選取在太湖中普遍存在的微囊藻(Microcystis)、小球藻(Chiorella vulgaris)和螺旋藻(Spirulina platensis)為研究對象。上述藻類均購買于中國科學(xué)院水生生物研究所國家淡水藻種庫，分離純化于太湖，其中微囊藻是引起藍(lán)藻水華的主要藻種，其他兩種藻類也是我國大部分富營養(yǎng)化湖泊廣泛分布的藻類。

本發(fā)明所用堿性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶均購自美國Sigma公司，其中，所述堿性磷酸酶來源為牛腸粘膜，固體粉末的活性為30U/mg；所述磷酸二酯酶來源為響尾蛇毒液，固體粉末的活性為0.02U/mg；所述植酸酶來源為小麥，固體粉末的活性為0.03U/mg。

實(shí)驗(yàn)方法如下：

1)有機(jī)磷水解酶溶液的配置

1.1)堿性磷酸酶溶液的配置方法：

取3.33mg堿性磷酸酶固體粉末，用0.1mol/L pH＝9.0的Tris-HCl緩沖溶液定容至100mL,配置成活性為1U/mL的堿性磷酸酶溶液；

1.2)堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合溶液的配置方法：

取10mg磷酸二酯酶固體粉末，用10mL活性為1U/mL的堿性磷酸酶溶液溶解，配置成活性為0.02U/mL的堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合溶液；

1.3)堿性磷酸酶、磷酸二酯酶與植酸酶組合溶液的配置方法：

A)取600mg植酸酶固體粉末，用1mol/L HAc-NaAc溶液定容至100mL，得活性為0.18U/mL的第一植酸酶溶液；

B)取5mL 0.18U/mL的第一植酸酶溶液，加入5mL 0.1mol/L pH＝7.0的Tris-HCl緩沖溶液，得活性為0.045U/mL的第二植酸酶溶液；

C)取20mg磷酸二酯酶固體粉末，加入10mL 0.045U/mL的第二植酸酶溶液，再加入10mL 1U/mL的堿性磷酸酶溶液，配置成活性為0.06U/mL的堿性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶組合溶液；

上述步驟1.1)-1.3)配置的三種酶溶液均置于4℃冷藏，且冷藏不得超過一星期，否則棄去重配；

2)酶水解實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿要先用HCl浸泡24h，洗凈后160℃高溫滅菌1h，整個(gè)操作在無菌臺進(jìn)行。

2.1)堿性磷酸酶水解實(shí)驗(yàn)

分別取藻類樣品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL錐形瓶中，設(shè)置對照組和處理組，向?qū)φ战M中添加200mL 0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液和1mL 1mol/L的迭代化納溶液，向處理組中添加190mL 0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液、1mL 1mol/L的NaN₃溶液和10mL 1U/mL的堿性磷酸酶溶液，兩組實(shí)驗(yàn)均放置在20℃恒溫培養(yǎng)箱中150r/min振蕩培養(yǎng)18h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行；

2.2)堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合使用的水解實(shí)驗(yàn)

分別取藻類樣品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL錐形瓶中，設(shè)置對照組和處理組，向?qū)φ战M中添加200mL 0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液和1mL 1mol/L的NaN₃溶液，向處理組中添加190mL 0.1mol/L pH＝9的Tris-HCl緩沖溶液、1mL 1mol/L的NaN₃溶液和10mL 0.02U/mL的堿性磷酸酶與磷酸二酯酶組合溶液，兩組實(shí)驗(yàn)均放置在20℃恒溫培養(yǎng)箱中150r/min振蕩培養(yǎng)18h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行；

2.3)堿性磷酸酶、磷酸二酯酶與植酸酶組合使用的水解實(shí)驗(yàn)

分別取藻類樣品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL錐形瓶中，設(shè)置對照組和處理組，向?qū)φ战M中添加200mL 0.1mol/L pH＝5.15的HAc-NaAc緩沖溶液和1mL 1mol/L的NaN₃溶液，向處理組中添加190mL0.1mol/L pH＝5.15的HAc-NaAc緩沖溶液，1mL 1mol/L的NaN₃溶液，和10mL0.06U/mL的堿性磷酸酶、磷酸二酯酶與植酸酶組合溶液，兩組實(shí)驗(yàn)均放置在20℃恒溫培養(yǎng)箱中150r/min振蕩培養(yǎng)18h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行；

分別取上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)中對照組和處理組培養(yǎng)后的上清液各10mL，10000r/min離心30min，過0.45μm濾膜，利用磷鉬藍(lán)比色法分別測定處理組酶培養(yǎng)后上清液中的總磷含量TP_處理組和無機(jī)磷含量P_i處理組，對照組培養(yǎng)后上清液中的總磷含量TP_對照組和無機(jī)磷含量P_i對照組，則加酶后上清液中有機(jī)磷P_o水解量＝P_i處理組-P_i對照組，測完上清液中的無機(jī)磷含量P_i后，其余的190mL上清液和殘?jiān)鋬龈稍?，為下一步測³¹P-NMR做準(zhǔn)備；

采用磷鉬藍(lán)法測定藻類對照組和處理組上清液中的TP時(shí)，需要往測定溶液中添加1mL質(zhì)量濃度為20％的十二烷基硫酸鈉溶液。

3)測液態(tài)³¹P-NMR

向冷干的殘?jiān)屑尤?0mL NaOH與EDTA組成的混合溶液，其中，NaOH的濃度為0.5mo/L，EDTA的濃度為0.25mmol/L，振蕩16h提取殘?jiān)械挠袡C(jī)磷，于10000r/min下離心30min后，0.45μm濾膜過濾，留取殘?jiān)械臑V后液冷干，得殘?jiān)鼮V后液；

把冷干后的上清液和殘?jiān)鼮V后液分別重新溶解于1mL NaOH與EDTA組成的混合溶液，其中，NaOH的濃度為1mo/L，EDTA的濃度為0.1mmol/L，超聲振蕩使其充分溶解，離心過濾后，分別測上清液和殘?jiān)鼮V后液中的液態(tài)³¹P-NMR，測試條件和儀器設(shè)置參數(shù)如下：

采用BRUKER標(biāo)準(zhǔn)腔5mm BBO探頭，³¹P的共振頻率為161.98Hz，測定溫度為20℃，譜峰寬度為5Hz，獲取時(shí)間AQ為0.2102s,³¹P-NMR參數(shù)中延遲時(shí)間D₁的設(shè)置為5s，分析測試時(shí)間為15h；

4)計(jì)算

通過步驟3)中得到的波譜進(jìn)行積分及對各磷組分進(jìn)行定性分析，并根據(jù)步驟3)得到的TP含量計(jì)算藻類中各磷組分的含量。

數(shù)據(jù)分析

液態(tài)³¹P-NMR數(shù)據(jù)采用MestReNova software 9.0軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果與討論

1、APase作用下藻類有機(jī)磷降解實(shí)驗(yàn)

1.1APase作用下藻類上清液磷組分組成特征

利用液態(tài)³¹P-NMR技術(shù)檢測湖泊藻類APase酶作用前后上清液中的磷組分，控制實(shí)驗(yàn)(Con)與處理實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，如圖1a-1c可以初步看出，未添加APase的樣品磷組分中的單酯磷區(qū)域(3.0-6.0ppm)的信號峰較為明顯，尤其是圖1b、1c，單酯磷區(qū)域的信號峰尖銳，并且所占總積分比例較大，當(dāng)添加APase培養(yǎng)18h后，各個(gè)樣品單酯磷區(qū)域的峰值均有較大幅度的下降，尤其為圖1b、1c，并且圖1b中的焦磷酸鹽在添加APase后幾乎全部降解。二酯磷(-1.0-2.5ppm)在添加APase酶后峰值呈現(xiàn)不同的變化，圖1b、1c的二酯磷區(qū)域峰值和積分比例有明顯降低。表1為湖泊藻類在APase作用下上清液中各磷組分的定量分析。

如表1，無機(jī)磷包括正磷酸鹽、焦磷酸鹽和多聚磷酸鹽三部分。有機(jī)磷包括單酯磷、二酯磷和膦酸鹽，其中單酯磷具有較高的穩(wěn)定性，而二酯磷穩(wěn)定性低于單酯磷，容易被微生物利用，膦酸鹽由于其C-P鍵的存在，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，一般亦不易被生物所利用。如表1，單酯磷包括植酸磷和其他單酯磷(除植酸磷以外的單酯磷)兩大部分，而其他單酯磷在湖泊藻類中又檢測到葡萄糖6磷酸、α甘油酯、β甘油酯、核苷酸以及一些未知其他單酯磷，二酯磷又包括磷酸酯、RNA、DNA以及一些未知的二酯磷。

如表1，湖泊藻類正磷酸鹽占溶解態(tài)總磷的比例除極個(gè)別樣品外均較高。在部分樣品中檢測到了多聚磷酸鹽組分，焦磷酸鹽只有在小球藻和螺旋藻的對照組中檢測到。表1中，其他單酯磷中的葡萄糖6磷酸一般容易被微生物利用。α和β甘油酯一般被認(rèn)為是磷脂的降解產(chǎn)物。本研究中二酯磷(-1.0-2.5ppm)主要劃分為三大類，第一類為DNA，其化學(xué)位移在-0.4±0.2ppm處，第二類為磷脂酸和RNA，其化學(xué)位移在-0.2-1.9ppm處，其余化學(xué)位移處歸為第三類(未知二酯磷組分)。

APase作用后上清液磷組分與控制實(shí)驗(yàn)磷組分之差(表2)，即為APase作用下藻類上清液磷組分比例的變化，若為正值，表明APase作用后磷組分增高，若為負(fù)值，表明APase作用后磷組分降低，從而模擬自然湖泊中藻類殘骸在APase的作用下磷組分向湖泊水體中釋放的過程以及在短期(18h)后磷組分的變化情況。如表2，在APase作用18h后，藻類中大部分單酯磷(甘油酯13.6％、核苷酸4.9％、未知單酯磷3.2％)、DNA(4.3％)、焦磷酸鹽(3.5％)和多聚磷酸鹽(0.8％)轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽(22.6％)和部分二酯磷(磷酸酯和RNA5.7％)及少量單酯磷組分(植酸磷0.23％、葡萄糖6磷酸0.7％)，藻類在APase作用下轉(zhuǎn)化正磷酸鹽的比例平均為22.6％。

這種有機(jī)磷在酶的作用下迅速降解為正磷酸鹽，可為藻類的再次生長繁殖提供充足的營養(yǎng)鹽，以此來維持水華的循環(huán)暴發(fā)。

1.2APase作用下藻類殘?jiān)捉M分組成特征

利用液態(tài)³¹P-NMR技術(shù)檢測湖泊藻類APase酶作用前后殘?jiān)械牧捉M分，對照實(shí)驗(yàn)(Con)與處理實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，如圖2a-2c可以初步看出，藻類中單酯磷區(qū)域(3-6ppm)的信號峰較為尖銳，且具有很多詳細(xì)的單酯磷組分。在添加APase后，微囊藻和小球藻樣品中的單酯磷峰值比對照實(shí)驗(yàn)中的單酯磷峰值明顯增高，通過積分，用藻類殘?jiān)偭着c各峰值對應(yīng)的磷組分相乘，得到各磷組分的積分比例，再計(jì)算出各磷組分的含量，以便于進(jìn)一步的分析。如表3，在APase作用后，檢測到植酸磷四種組分，分別是chiro-IP6、neo-IP6、myo-IP6和scyllo-IP6，其中chiro-IP6在大部分樣品APase作用前后均可檢測到，占?xì)堅(jiān)偭椎?.4-20.1％。

如圖2a-2c，藻類殘?jiān)辛捉M分種類十分豐富，多達(dá)15種有機(jī)磷組分，除四種植酸磷組分和DNA組分以外，還有10中其他單酯磷組分，其中有核苷酸類(2'鳥苷酸、3'鳥苷酸、5'鳥苷酸、AMP)，還檢測到兩種新的磷組分，即乙醇胺磷酸(O-phosphorylethanolamine，P-ine)和磷酯酸(3-sn Phosphatidic acid，P-acid)。

2、APase+PDEase作用下藻類有機(jī)磷降解實(shí)驗(yàn)

2.1APase+PDEase作用下樣品上清液磷組分組成特征

堿性磷酸酶(APase)與磷酸二酯酶(PDEase)組合可以水解單酯磷和二酯磷以及聚合態(tài)磷，從圖3a-3c可以看出，二酯磷區(qū)域(-1-2.5ppm)在添加了APase+PDEase后，除個(gè)別樣品以外峰值均有明顯的降低，單酯磷峰值較對照實(shí)驗(yàn)也有明顯的降低趨勢。

如表5，添加APase+PDEase后，藻類上清液中的正磷酸鹽占上清液總磷的百分比為74.1-90.9％，平均值為85.5％，焦磷酸鹽只在小球藻對照實(shí)驗(yàn)中檢測出來，植酸磷、α甘油酯、β甘油酯和核苷酸等單酯磷組分在藻類樣品中亦檢測出來，這表明在APase+PDEase作用下藻類死亡腐爛分解后的產(chǎn)物貢獻(xiàn)較大。如表5，在APase+PDEase作用后，溶解于上清液中的正磷酸鹽均有增加，其平均占上清液總磷的36.7％，藻類礦化為正磷酸鹽的比例分別占上清液總磷的36.7％，為內(nèi)源磷貢獻(xiàn)的重要污染源。

表5APase+PDEase作用下藻類上清液磷組分含量(mg/kg)及比例

注：^aB1、B2、B3分別代表微囊藻、小球藻和螺旋藻樣品，2e代表APase+PDEase。

^b括號里數(shù)值為藻類上清液各磷組分占其上清液總磷的比例。

^c“-”表示未檢出。

表6APase+PDEase作用下藻類上清液磷組分比例變化

注：表中數(shù)值為藻類上清液各磷組分占其上清液總磷的比例(％)。

2.2APase+PDEase作用下藻類殘?jiān)捉M分組成特征

如圖4a-4c，在APase+PDEase作用下，有部分有機(jī)磷在短期內(nèi)不能溶解于水體中，因此隨藻類殘骸沉降下來。通過液態(tài)³¹P-NMR檢測，藻類殘?jiān)辛捉M分種類豐富，在單酯磷區(qū)域中有很多尖銳的峰信號，在大部分樣品中均檢測到二酯磷的存在。通過積分計(jì)算，殘?jiān)辛捉M分的含量及占?xì)堅(jiān)黅P的百分比詳見表7。

如表7，在藻類殘?jiān)?，檢測到磷組分比上清液中種類豐富，其中檢測到2種無機(jī)磷組分、13種有機(jī)磷組分，其中有機(jī)磷組分中含有11種單酯磷組分，單酯磷組分中含有4種植酸磷組分(chiro-、neo-、myo-、scyllo-)、3種糖磷組分(果糖1磷酸、果糖6磷酸和葡萄糖1磷酸)、1種核苷酸組分、1種甘油酯組分、1種乙醇胺磷酸以及未知單酯磷組分。在以往研究中，僅把單酯磷當(dāng)做一個(gè)整體，沒有詳細(xì)劃分其單酯磷組分。如表8，正值表示在酶作用下磷組分含量增加，負(fù)值為磷組分含量降低，則在APase+PDEase酶作用下，藻類中的焦磷酸鹽、植酸磷、核苷酸、磷酯酸以及二酯磷等轉(zhuǎn)化為生物可直接利用的正磷酸鹽。

3、APase+PDEase+Phytase作用下藻類有機(jī)磷降解實(shí)驗(yàn)

3.1APase+PDEase+Phytase作用下藻類上清液磷組分組成特征

添加APase+PDEase+Phytase后，用液態(tài)³¹P-NMR檢測藻類上清液中的磷組分如圖5a-5c。如圖5a-5c，藻類上清液中的單酯磷組分和焦磷酸鹽組分峰值尖銳，在酶作用后，焦磷酸鹽組分均降解，單酯磷組分降解程度也較為明顯。

如表9，在酶作用下，藻類上清液正磷酸鹽組分占上清液總磷的82.4％(平均值為4622mg/kg)，在藻類樣品中對照組圖譜中檢測到焦磷酸鹽和多聚磷酸鹽組分，而添加三種酶后，在其上清液中未檢測到焦磷酸鹽和多聚磷酸鹽，表明在三種酶的作用下，這兩種容易分解的組分被酶所降解，形成無機(jī)磷組分或者轉(zhuǎn)化為其他磷組分。在微囊藻上清液對照組實(shí)驗(yàn)中檢測到植酸磷的存在(318mg/kg，占上清液總磷的4.2％)，這表明絕大多數(shù)植酸磷并未釋放至上清液中，這可能與植酸酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有關(guān)。如表9，在藻類上清液中均檢測到葡萄糖6磷酸組分，這表明葡萄糖6磷酸組分易溶于水，是生物利用的潛在磷源，α甘油酯和β甘油酯在藻類樣品上清液中檢測到。除單酯磷組分以外，二酯磷組分中的磷酯酸和RNA在藻類樣品中也檢測到，把添加三種酶后的上清液磷組分與對照實(shí)驗(yàn)上清液組分相減，得到添加三種酶后藻類樣品上清液中磷組分的變化趨勢，詳細(xì)見表10。

與添加APase和APase+PDEase類似，添加三種酶后的上清液磷組分均會發(fā)生有機(jī)磷的降解，無機(jī)磷組分的升高，但不同酶組合作用下，降解率程度有較大差異。如表10，在三種酶的作用下，藻類上清液中有機(jī)磷占上清液TP的22.6％(平均值)發(fā)生水解，其中水解的單酯磷組分占上清液TP的23.3％，二酯磷中的磷酯酸和RNA組分占上清液TP的比例有略微上升。藻類單酯磷中溶于上清液中的植酸磷(平均0.9％)、葡萄糖6磷酸(平均1.9％)、α甘油酯(平均2.4％)、β甘油酯(平均0.2％)、未知單酯磷(平均6.0％)在三種酶的作用下均發(fā)生降解，與此同時(shí)，藻類中的焦磷酸鹽(平均11.2％)和多聚磷酸鹽(平均1.4％)在三種酶的作用下也發(fā)生水解，而容易被生物直接利用的正磷酸鹽在三種酶的作用下有較大幅度的升高，平均升高的比例占上清液TP的35.3％。藻類上清液在這三種酶的作用下礦化率占總礦化率的96.7％。這比僅在APase作用下藻類礦化率(73.1％)和APase+PDEase作用下藻類礦化率(89.5％)均要高，這表明在三種酶的聯(lián)合作用下藻類溶于水中的有機(jī)磷將最大程度的降解為無機(jī)磷組分，使得生物有效性發(fā)揮到最大，而自然富營養(yǎng)化湖泊水體中廣泛存在著三種酶，而且通常均是聯(lián)合作用于藻類殘骸的，使之在腐爛消亡過程中有機(jī)磷釋放或分解到湖泊自然水體中，使水體中活性磷的濃度增高，進(jìn)一步補(bǔ)充由于藻類暴發(fā)所消耗掉的無機(jī)磷組分，藻類殘骸中的有機(jī)磷組分在短時(shí)間內(nèi)(18h)迅速礦化，用來快速補(bǔ)充營養(yǎng)鹽以維持藻類循環(huán)往復(fù)暴發(fā)，這就是藻類這種內(nèi)源磷在水華暴發(fā)中起到的重要作用和循環(huán)機(jī)理。

表9APase+PDEase+Phytase作用下藻類上清液磷組分含量(mg/kg)及比例

注：^aB1、B2、B3分別代表微囊藻、小球藻和螺旋藻樣品，3e代表APase+PDEase+Phytase，Con為對照組。

^b括號里數(shù)值為藻類上清液各磷組分占上清液總磷的比例。

^c“-”表示未檢出。

表10APase+PDEase+Phytase作用下藻類上清液磷組分比例變化

注：^a表里數(shù)值為藻類上清液各磷組分占上清液總磷的比例。

^b“-”表示未檢出。

3.2APase+PDEase+Phytase作用下藻類殘?jiān)捉M分組成特征

如圖6a-6c，在添加三種酶后，利用液態(tài)³¹P-NMR技術(shù)進(jìn)行檢測，藻類殘?jiān)械膯熙チ缀投チ讌^(qū)域的峰值均有明顯的降低趨勢，這表明三種酶水解了大部分的單酯磷和二酯磷。

如表11，在三種酶作用下，利用液態(tài)³¹P-NMR技術(shù)檢測出藻類殘?jiān)泻姓姿猁}占?xì)堅(jiān)偭椎?7.4％-100％。有機(jī)磷中檢測到單酯磷(包括四種植酸磷的同分異構(gòu)體、果糖6磷酸、核苷酸以及一些未知單酯磷)和二酯磷(磷酯酸、RNA、DNA等)。通過處理組(即添加三種酶后)與對照組(Con)的差值，計(jì)算并繪制出藻類殘?jiān)辛捉M分變化率(表12)。

表11APase+PDEase+Phytase作用下藻類殘?jiān)捉M分含量(mg/kg)及比例

注：^aB1、B2、B3分別代表微囊藻、小球藻和螺旋藻，2e代表APase+PDEase。

^bchiro-、neo-、myo-和scyllo-：植酸磷的四種同分異構(gòu)體。

^c括號里數(shù)值為在APase+PDEase作用下藻類殘?jiān)髁捉M分占其殘?jiān)偭椎谋壤?/p>

^d“-”表示未檢出。

表12APase+PDEase+Phytase作用下藻類殘?jiān)捉M分比例變化

注：^a“-”表示未檢出。

如表11，添加三種酶后，藻類轉(zhuǎn)化成的正磷酸鹽平均百分比占?xì)堅(jiān)偭椎?2.7％，其中轉(zhuǎn)化的這部分有機(jī)磷中包含單酯磷和二酯磷。而單酯磷中又有植酸磷、果糖6磷酸以及核苷酸等組分發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為生物可直接利用的正磷酸鹽。

綜上所述，本申請將生物化學(xué)手段(有機(jī)磷水解酶)與液態(tài)³¹P-NMR技術(shù)相結(jié)合，以湖泊藻類有機(jī)磷組成特征及其生物有效性為主線，探討其生物地球化學(xué)循環(huán)，發(fā)現(xiàn)了藻類在各種生物酶的作用下，在短時(shí)間內(nèi)P_o快速降解成生物可利用性磷，維持了湖泊水體中藻類的生長繁殖，使得水華暴發(fā)循環(huán)往復(fù)進(jìn)行，表明這些引起水華的藻類死亡后P_o再循環(huán)對湖泊藍(lán)藻再暴發(fā)及湖泊P_o生物地球化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生了重要影響，關(guān)于P_o導(dǎo)致藍(lán)藻再暴發(fā)的定量化結(jié)論，對富營養(yǎng)化湖泊管理具有重要參考。

本發(fā)明在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，又對藻類有機(jī)磷對太湖內(nèi)源磷的貢獻(xiàn)進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下：

材料與方法

樣品來源

以太湖為例進(jìn)行有機(jī)磷降解量的估算。樣品為典型富營養(yǎng)化湖泊的優(yōu)勢藻類(微囊藻、小球藻、螺旋藻)。

數(shù)據(jù)分析

1)根據(jù)太湖藻類2012年的生物量以及太湖湖水體積，計(jì)算出太湖藻類總生物量；

2)通過藻類中有機(jī)磷的質(zhì)量濃度，計(jì)算出太湖藻類有機(jī)磷的總量；

3)根據(jù)藻類在各種生物酶(APase、APase+PDEase、APase+PDEase+Phytase)作用下向湖泊水體釋放的有機(jī)磷比例和暫時(shí)埋藏于沉積物中有機(jī)磷的比例，計(jì)算出各種生物酶作用下藻類釋放于湖泊水體和沉降至沉積物中的有機(jī)磷的量；

4)通過上個(gè)實(shí)驗(yàn)液態(tài)³¹P-NMR確定的藻類在各種酶作用下有機(jī)磷降解為正磷酸鹽的比例，計(jì)算出藻類有機(jī)磷在湖泊水體和沉積物各種酶作用下轉(zhuǎn)化為可直接被生物利用的正磷酸鹽(Orth-P)的量；

5)最后匯總出藻類有機(jī)磷在短期(18h)后直接以及間接釋放至湖泊水體中的生物可利用性量。

結(jié)果與討論

藻類有機(jī)磷降解為生物可利用性磷量的估算

根據(jù)表13中的太湖藻類和湖水體積相乘，計(jì)算出太湖藻類總生物量為6.012×10⁴t。

表13太湖基本指標(biāo)及藻類生物量

Yu,T.；Yuan,Z.；Fengchang,W.,et al.Six-Decade Change in Water Chemistry of Large Freshwater Lake Taihu,China[J].Environmental Science&Technology,2013,47(16):9093-9101.

根據(jù)藻類總生物量與藻類有機(jī)磷的質(zhì)量濃度相乘，計(jì)算出藻類有機(jī)磷的量，分別為333.8t(圖7)，再根據(jù)表14中的各種比例與藻類有機(jī)磷的量相乘，計(jì)算出藻類在各種生物酶作用下有機(jī)磷在水體以及沉積物中的釋放及轉(zhuǎn)化量，并估算出了太湖藻類有機(jī)磷在各種酶作用下各個(gè)路徑中的降解量及轉(zhuǎn)化量(圖7)。

從圖7中可以看出，太湖藻類在APase、APase+PDEase、APase+PDEase+Phytase的作用下可轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽的量分別為25.3t、75.3t和110.0t，分別約占太湖藻類總有機(jī)磷量(333.8t)的7.6％、22.5％和33.0％。APase與PDEase這兩種酶在偏堿性湖泊水體中活性較強(qiáng)，而Phytase在中性湖泊水體中活性較強(qiáng)，太湖屬于中性偏堿性湖泊，其pH在7.72-8.65，但是在自然湖泊中，這三種酶一般是同時(shí)存在的，可能會因?yàn)楹此w的溫度、pH值等環(huán)境條件的差異，三種酶所占的比例不同而已。

綜上所述，藻類有機(jī)磷在各種生物酶的作用下轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽的比例為7.6％-33.0％，其降解的正磷鹽酸量可以快速補(bǔ)充湖泊水體中的生物可利用性磷量，有研究報(bào)道，太湖全年磷酸鹽(PO₄^3--P)的釋放量達(dá)900t，而本研究估算出的藻類在三種酶同時(shí)存在時(shí)轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽的量分別為110.0t，因此太湖藻類占總磷酸鹽釋放量的12.2％，其余的可能來源于沉積物的釋放。

表14各種生物酶作用下藻類有機(jī)磷釋放及降解比例

藻類有機(jī)磷在湖泊水體中的循環(huán)過程

由圖7可知，湖泊藻類在各種生物酶的作用下，分別有22.6％-36.7％的有機(jī)磷直接釋放至湖泊水體轉(zhuǎn)化為生物可利用性磷，分別有6.8％-32.7％的有機(jī)磷間接(在沉積物中各種生物+酶的作用下)釋放至湖泊水體中轉(zhuǎn)化為生物可利用性磷。如圖8，湖泊藻類死亡腐爛分解后，在各種生物酶及微生物的作用下其體內(nèi)的有機(jī)磷一部分會釋放到湖泊水體中，轉(zhuǎn)化為生物可直接利用的正磷酸鹽組分(即生物可利用性磷)，另一部分有機(jī)磷則通過沉降作用埋藏于湖泊沉積物中，在沉積物中各種生物酶及微生物的作用下，這部分藻類殘骸中的有機(jī)磷將進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為生物可利用性磷，隨著沉積物向上覆水體中的釋放作用再次進(jìn)入到湖泊水體中，則藻類直接進(jìn)入水體中的生物可利用性磷和通過沉積物酶作用再次釋放到湖泊水體中的生物可利用性磷總量提供了藍(lán)藻水華二次暴發(fā)所需要的磷源，快速補(bǔ)充由于藍(lán)藻暴發(fā)所消耗掉的磷，從而引起藍(lán)藻水華的循環(huán)往復(fù)暴發(fā)。這基本就是湖泊典型藻類腐解后有機(jī)磷在湖泊水體中的循環(huán)過程。

湖泊生態(tài)修復(fù)及內(nèi)源污染治理的主要措施

湖泊內(nèi)源磷的主要來源為藻類殘骸的腐爛分解以及沉積物的釋放，因此在控制外源污染的同時(shí)，對藻類和沉積物的治理對改善湖泊富營養(yǎng)化現(xiàn)象具有重大意義。有研究表明，藍(lán)藻打撈可以有效消除藍(lán)藻水華暴發(fā)現(xiàn)象，增加除藍(lán)藻以外的其他藻類細(xì)胞的豐度，同時(shí)可以有效削減湖泊水體中的氮、磷營養(yǎng)鹽以及內(nèi)源累計(jì)量，其發(fā)現(xiàn)兩個(gè)有效打撈參數(shù)，分別是每天一次和兩天一次。使用泥漿泵打撈藍(lán)藻可以每天撈取藻水2000t，通過管道運(yùn)輸送到附近的藻水分離站，分離后的藻泥成為有機(jī)肥輸運(yùn)到農(nóng)田中已達(dá)到循環(huán)利用。除了物理打撈藍(lán)藻以外，還有添加化學(xué)試劑除藻，近些年來，有研究報(bào)道采用季銨鹽型表面活性劑去除銅綠微囊藻，取得了較好的效果。對于沉積物的釋放，近些年來，在太湖采取底泥疏浚生態(tài)清淤的方式取得了較好的效果。

本發(fā)明對湖泊內(nèi)源中的藻類來源的有機(jī)磷提取方法、組成特征以及生物有效性進(jìn)行了系統(tǒng)了研究與分析，并且以太湖為例，進(jìn)行了藻類有機(jī)磷在湖泊各種酶的作用下降解為生物可利用性磷的量進(jìn)行了初步估算，研究這種內(nèi)源污染源有機(jī)磷的生物地球化學(xué)機(jī)理與循環(huán)過程，希望對復(fù)雜的湖泊富營養(yǎng)化過程及長年暴發(fā)的藍(lán)藻水華現(xiàn)象提供微小的進(jìn)步與貢獻(xiàn)，為早日恢復(fù)健康的生態(tài)系統(tǒng)貢獻(xiàn)一份綿薄之力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。