本發(fā)明涉及一種采用反硝化菌菌株原位修復(fù)富氮地?zé)崴Ч哪M實(shí)驗(yàn)裝置及其實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

地下水硝酸鹽原位微生物處理技術(shù)是指將受到硝酸鹽污染的地下水體依賴反硝化細(xì)菌和人為創(chuàng)造的促進(jìn)反硝化反應(yīng)的條件直接在原地進(jìn)行處理。反硝化細(xì)菌原位修復(fù)技術(shù)作為地下水脫氮的一種方式，具有方法簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、反應(yīng)迅速，受外界環(huán)境影響較小等特點(diǎn)，該技術(shù)在處理富氮地下水中具有重要的地位和廣闊的應(yīng)用前景。獲得有效的反硝化細(xì)菌是原位微生物修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的關(guān)鍵。環(huán)境不同，適合的反硝化細(xì)菌也不盡相同，因此通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬研究選擇適合的反硝化菌能有效的提高反硝化效率。

現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)裝置采用SY-3005QB發(fā)酵罐，該發(fā)酵罐是帶攪拌的夾套式加熱的SY-3000系列生物發(fā)酵罐的一種。罐體體積為5L，發(fā)酵罐罐體采用硼硅玻璃組成，蓋板采用不銹鋼316L組成。其控制系統(tǒng)是基于工業(yè)以太網(wǎng)控制技術(shù)的新一代生物發(fā)酵成套系統(tǒng)，代表了目前國(guó)內(nèi)發(fā)酵罐自動(dòng)控制系統(tǒng)的最高水平。SY-3005QB發(fā)酵罐主要由罐體、攪拌器和擋板、消泡器、聯(lián)軸器和軸承、變速裝置、空氣分布裝置、軸封以及換熱裝置組成。罐頂裝有視鏡及燈鏡，進(jìn)料管，補(bǔ)料管、排氣管、接種管和壓力表接管。罐身上設(shè)有冷卻水進(jìn)出管，進(jìn)空氣管、溫度計(jì)管和檢測(cè)儀表接口，其側(cè)壁設(shè)置有取樣口。攪拌器的主要作用是使通入的空氣分散成氣泡并與發(fā)酵液充分混合，使氣泡細(xì)碎以增大氣——液界面，來(lái)獲得所需要的溶解氧速率，并使生物細(xì)胞懸浮分散于發(fā)酵體系中，以維持適當(dāng)?shù)臍狻骸蹋?xì)胞）三相的混合與質(zhì)量傳遞，同時(shí)強(qiáng)化傳熱過(guò)程。現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法為：使用硝酸鹽和亞硝酸鹽配置所需模擬地?zé)崴?21℃滅菌20min后裝入發(fā)酵罐中，按5%（v/v）的比例接入標(biāo)準(zhǔn)種子液，每隔2h檢測(cè)混合液的NO₃--N、NO₂--N、TN的濃度。為模擬反硝化細(xì)菌原位修復(fù)富氮地?zé)崴恼鎸?shí)情況，盡可能還原取水熱儲(chǔ)層的原始環(huán)境，設(shè)置初始pH值為8.16、溫度為38.9℃、溶解氧為2.57 mg/L。相同條件下以未接種的模擬地?zé)崴ü摅w滅菌，培養(yǎng)基不滅菌）作為空白對(duì)照。由于深層地?zé)崴疁仄毡檩^高，因此篩選耐高溫的高效反硝化菌很有必要，菌種應(yīng)在高溫條件下進(jìn)行長(zhǎng)期馴化，方能使其更好地適應(yīng)地?zé)崴钠邷丨h(huán)境。但是現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)儀器相對(duì)簡(jiǎn)單且環(huán)境還原能力不強(qiáng)，難以反映復(fù)雜的現(xiàn)場(chǎng)地?zé)崴牡刭|(zhì)特征，因此現(xiàn)有的原位修復(fù)富氮地?zé)崴覂?nèi)模擬并不能完全代表實(shí)際情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種模擬效果佳、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)的原位修復(fù)富氮地?zé)崴Ч哪M實(shí)驗(yàn)裝置及其實(shí)驗(yàn)方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：原位修復(fù)富氮地?zé)崴Ч哪M實(shí)驗(yàn)裝置，包括電腦、試驗(yàn)臺(tái)和位于試驗(yàn)臺(tái)一側(cè)的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器，電腦放置在試驗(yàn)臺(tái)上表面，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器包括支撐框架、保溫桶和漏桶，支撐框架外型呈圓柱形，支撐框架頂部外緣設(shè)有環(huán)形的連接法蘭；

保溫桶設(shè)在支撐框架內(nèi)，保溫桶包括上下通透的外桶體和內(nèi)桶體，外桶體的中心線沿垂直方向設(shè)置，內(nèi)桶體的半徑小于外桶體的半徑，內(nèi)桶體同軸線設(shè)置在外桶體內(nèi)，外桶體的底部與內(nèi)桶體的底部之間固定設(shè)有環(huán)形的連接板，外桶體的內(nèi)壁與內(nèi)桶體的外壁之間形成保溫腔室，連接板上設(shè)有位于保溫腔室內(nèi)的電阻加熱器，外桶體頂部的外緣固定設(shè)有環(huán)形的外法蘭盤，內(nèi)桶體頂部的外緣固定設(shè)有環(huán)形的內(nèi)法蘭盤，內(nèi)桶體頂部的內(nèi)側(cè)壁上設(shè)有環(huán)形的臺(tái)階，保溫桶的外法蘭盤設(shè)置在支撐框架的連接法蘭上，保溫桶頂部設(shè)有蓋體，蓋體、外法蘭盤和連接法蘭之間穿設(shè)有外螺栓，蓋體與內(nèi)法蘭盤之間穿設(shè)有內(nèi)螺栓；內(nèi)桶體內(nèi)滑動(dòng)密封連接有活塞，活塞的上表面上固定設(shè)有擾動(dòng)泵，活塞底部連接有電動(dòng)絲杠升降機(jī)，活塞上穿設(shè)有上端凸出于活塞上表面的蒸汽接入管，蒸汽接入管上端設(shè)有頂部呈球形的端蓋，端蓋上設(shè)有通氣孔，蒸汽接入管上設(shè)有單向閥，活塞上穿設(shè)有出料管，出料管下端設(shè)有位于活塞下方的三通接頭，三通接頭的第二個(gè)接口通過(guò)水樣管連接有水樣檢測(cè)儀，三通接頭的第三個(gè)接口通過(guò)廢液管連接有廢液處理桶，水樣管上設(shè)有第三閥門，廢液管上設(shè)有第四閥門，廢液處理桶上設(shè)有水泵；

漏桶位于保溫桶內(nèi)，漏桶的頂部外緣設(shè)有環(huán)形的壓接板，漏桶底部開設(shè)有漏孔，壓接板位于內(nèi)桶體頂部的臺(tái)階上；

蓋體頂面設(shè)有pH檢測(cè)儀和壓力檢測(cè)儀，蓋體上穿設(shè)有下端伸入到內(nèi)桶體內(nèi)的投料管和循環(huán)進(jìn)料管，投料管上設(shè)有梯度加熱裝置和第一閥門，循環(huán)進(jìn)料管上設(shè)有第二閥門，循環(huán)進(jìn)料管的另一端與水泵的出水口連接，蓋體底面上設(shè)有位于漏桶內(nèi)的溫度傳感器和pH傳感器，pH傳感器通過(guò)信號(hào)線與pH檢測(cè)儀連接，溫度傳感器、pH檢測(cè)儀和壓力檢測(cè)儀分別通過(guò)信號(hào)線與電腦連接。

漏桶的外壁上沿軸向方向開設(shè)有直線型的縫隙。

漏桶頂面與蓋體底面之間設(shè)有橡膠密封圈。

原位修復(fù)富氮地?zé)崴Ч哪M實(shí)驗(yàn)裝置的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

（1）、制備與實(shí)際熱儲(chǔ)條件相似的模擬地?zé)崴畼?、介質(zhì)巖樣以及菌株；

（2）、檢查保溫桶是否漏水，接著采用蒸汽滅菌鍋對(duì)步驟（1）中制備的介質(zhì)巖樣進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為30min；

（3）、開始進(jìn)行修復(fù)富氮地?zé)崴哪M實(shí)驗(yàn)，對(duì)模擬反應(yīng)后的混合液進(jìn)行NO₃--N、NO₂--N、TN濃度檢測(cè)。

步驟（1）中模擬地?zé)崴畼拥呐渲品椒ㄊ牵簻囟葹?8 ℃，總活潑陽(yáng)離子為273.28 mg/L，總活潑陰離子為659.37 mg/L，總有機(jī)碳（TOC)為3.8 %，選取琥珀酸鈉2.36g、KNO₃0.361 g、KNO₂ 0.304g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、KH₂PO₄ 1.0g、K₂HPO₄ 5.0g、NaCl 0.5g和微量元素溶液，進(jìn)行混合并用取自現(xiàn)場(chǎng)的地?zé)崴ㄈ葜?000 mL的混合液，調(diào)節(jié)混合液的pH值為8.0；其中微量元素溶液的成分配比為：Na₂SeO₃ 0.005g，CoCl₂·6H₂O 0.1 g，NiCl₂ 0.05 g Na₂MoO₄ 0.005 g，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g，CaCl₂ 0.1 g，BaCl₂ 0.002g ，CuSO₄·5H₂O 0.01 g, MnSO₄·H₂O 0.5 g, FeSO₄ 0.02 g, MgSO₄·7H₂O 3 g，H₃BO₃ 0.01 g，NTA 1.5 g和水溶液混合。

步驟（1）中介質(zhì)巖樣制備的具體過(guò)程為：實(shí)驗(yàn)填充的巖樣采用擾動(dòng)細(xì)砂土，從距地表深度約60 m的巖層中采集巖樣，然后將采集的巖樣在室溫下自然風(fēng)干，然后去除巖樣中的雜質(zhì)，最后經(jīng)篩孔半徑為2 mm的篩網(wǎng)過(guò)濾后備用；

步驟（1）中菌株制備的具體方法包括以下步驟：

①反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)：從實(shí)驗(yàn)所在地深地?zé)峋谐槿〕龅責(zé)崴?，接著量?0ml地?zé)崴鳛闃悠凡⒎湃氲?50ml的三角瓶中，然后向三角瓶中加入經(jīng)滅菌過(guò)的100ml的LB液體培養(yǎng)基，把三角瓶放置在溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為60 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待三角瓶中的培養(yǎng)液渾濁后，取出10ml的培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)接到滅菌后的液體反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中，之后每隔12h分別用二苯胺試劑和格利斯試劑定性檢測(cè)液體反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)液中NO₃^-和NO₂^-的含量，當(dāng)液體反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)液中的NO₃^-含量明顯下降且有NO₂^-產(chǎn)生時(shí)，取出10ml的培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)液中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，富集四代后備用；

②反硝化細(xì)菌的分離純化：用十倍稀釋法，采用移液槍吸取100 μL菌懸液，加入900 μL無(wú)菌水中，充分混勻，此為10^-1倍稀釋液，以此類推逐步稀釋為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6菌懸液，分別取200 μL各梯度菌懸液用涂布棒均勻涂布于溴百里酚藍(lán)（BTB）培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)基上，然后將平板培養(yǎng)基倒置在溫度為35℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3d，之后用接種環(huán)挑取周圍出現(xiàn)藍(lán)色光暈的單菌落進(jìn)行分離，此為初篩菌株，將初篩菌株分別挑取接種于新鮮的平板培養(yǎng)基上，于35℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，再次挑取單菌落劃線分離，重復(fù)三次之后，將細(xì)胞涂片染色，用顯微鏡檢查菌株是否為單一菌種，若發(fā)現(xiàn)有雜菌，須再次重復(fù)分離、純化，直到獲得純菌落，把純化的菌株進(jìn)行編號(hào)，斜面培養(yǎng)后置4℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?/p>

③反硝化性能測(cè)定：在試管中加入10 mL反硝化性能測(cè)定培養(yǎng)液，并將德漢氏小管傾斜倒置放入試管底部，將步驟②中純化好的菌株經(jīng)平板劃線活化，然后用接種環(huán)挑接于培養(yǎng)液中，接著在溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為60 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)，定時(shí)觀察德漢氏小管中產(chǎn)氣速度的快慢和產(chǎn)氣量的多少，用以定量判定菌株反硝化性能的強(qiáng)弱，篩選出高效菌株，以備實(shí)驗(yàn)所用。

步驟（2）中檢查保溫桶是否漏水的過(guò)程為：向保溫桶的內(nèi)桶體內(nèi)加入適量的水，檢查內(nèi)桶體是否漏水，確認(rèn)不漏水后蓋上蓋體，重新將外螺栓和內(nèi)螺栓擰緊；

步驟（2）中介質(zhì)巖樣的滅菌過(guò)程為：將制備的巖樣放入蒸汽滅菌鍋內(nèi)，經(jīng)蒸汽滅菌鍋滅菌30分鐘后，再將滅菌后的巖樣裝填在漏桶內(nèi)。

步驟（3）的具體方法為：

Ⅰ、打開外螺栓和內(nèi)螺栓，取下蓋體，將厚度為10μm的尼龍濾布放置在漏桶的底部，然后依次向漏桶內(nèi)填裝厚度為2cm的粗粒石英砂、土柱、2cm的粗粒石英砂，其中土柱是由制備的介質(zhì)巖樣制成；

Ⅱ、打開第一閥門，通過(guò)操控電腦控制電動(dòng)絲杠升降機(jī)，以驅(qū)動(dòng)活塞沿內(nèi)桶體的內(nèi)壁向下運(yùn)動(dòng)，使保溫桶的內(nèi)部空間達(dá)到最大，然后通過(guò)蒸汽接入管向保溫桶內(nèi)通入蒸汽，通入蒸汽時(shí)間為30分鐘，結(jié)束后關(guān)閉第一閥門；

Ⅲ、通過(guò)電腦設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度和投料溫度，啟動(dòng)電阻加熱器和梯度加熱裝置，當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度達(dá)到設(shè)定值后，打開第一閥門，通過(guò)投料管向保溫桶內(nèi)注入接種反硝化菌A1的模擬地?zé)崴?，注入完畢后關(guān)閉第一閥門，電腦設(shè)定實(shí)驗(yàn)壓力，啟動(dòng)電動(dòng)絲杠升降機(jī)，電動(dòng)絲杠升降機(jī)驅(qū)動(dòng)活塞移動(dòng)，使內(nèi)桶體內(nèi)的氣壓達(dá)到設(shè)定壓力值后，再通過(guò)電腦啟動(dòng)擾動(dòng)泵；

Ⅳ、經(jīng)過(guò)K分鐘后，打開第三閥門，將適量的保溫桶內(nèi)的水樣通過(guò)水樣管送至水樣檢測(cè)儀，關(guān)閉第三閥門，利用水樣檢測(cè)儀檢測(cè)水樣中氮元素含量，電腦記錄氮元素含量值，以后每隔K分鐘測(cè)試水樣中的氮含量，并繪制出水樣中的氮含量隨時(shí)間變化的曲線圖；

Ⅴ、得到氮含量隨時(shí)間變化的關(guān)系圖后結(jié)束試驗(yàn)，打開第四閥門和第二閥門，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)后的模擬混合液流入到廢液處理桶內(nèi)進(jìn)行處理，然后啟動(dòng)水泵，將處理后的模擬混合液經(jīng)循環(huán)進(jìn)料管再次注入到漏桶內(nèi)循環(huán)利用。

采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、采用電腦作為整個(gè)系統(tǒng)的控制端和數(shù)據(jù)反饋端，使得整個(gè)系統(tǒng)的智能化程度大大提高，內(nèi)部程序會(huì)根據(jù)事先設(shè)定好的壓力和溫度參數(shù)控制相應(yīng)執(zhí)行器進(jìn)行工作，基于各種傳感器的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器運(yùn)行狀況監(jiān)測(cè)，使得其監(jiān)測(cè)結(jié)果更為精確，減少了人工操作的誤差；

2、投料管上安裝梯度加熱裝置可以很好的模擬將菌株從正常溫度投遞至工作溫度的狀態(tài)，這對(duì)檢驗(yàn)菌株的耐熱沖擊能力和環(huán)境適應(yīng)能力有很大的幫助；

3、恒溫水浴下的保溫桶能根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件維持不同的溫度，設(shè)置在漏桶外的擾動(dòng)泵能夠激勵(lì)被水浴加熱的模擬水，從而很好模擬熱儲(chǔ)環(huán)境中地下水的運(yùn)動(dòng)；

4、電動(dòng)絲杠升降機(jī)用于使保溫桶內(nèi)的壓力恒定不變，能夠合理模擬出深埋地?zé)崴母邏涵h(huán)境，有益于篩選菌株和強(qiáng)化還原環(huán)境；

5、水樣檢測(cè)儀可以檢測(cè)保溫桶內(nèi)除氮效果，如果除氮效果不明顯，則將反應(yīng)后的模擬水注入廢液處理桶進(jìn)行處理，然后再經(jīng)循環(huán)進(jìn)料管重新注入到漏桶內(nèi)，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)藥品，減少了配制模擬水的時(shí)間，大大提高了試驗(yàn)效率；

6、步驟（3）中第Ⅱ步向保溫桶內(nèi)通入30min蒸汽，目的是對(duì)保溫桶進(jìn)行消毒以及提升保溫桶內(nèi)部空間的溫度，用以模擬地溫梯度。

綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，控制電腦作為整個(gè)系統(tǒng)的控制端和數(shù)據(jù)反饋端，使得整個(gè)系統(tǒng)的智能化程度大大提高，梯度加熱裝置可以很好的模擬菌株使用前的投料狀態(tài)，擾動(dòng)泵和電動(dòng)絲杠升降機(jī)可以很好的模擬地?zé)崴臒醿?chǔ)環(huán)境，克服了以往實(shí)驗(yàn)儀器的不足，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是圖1中活塞以下機(jī)構(gòu)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是蓋體的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

如圖1-4所示，本發(fā)明的原位修復(fù)富氮地?zé)崴Ч哪M實(shí)驗(yàn)裝置，包括電腦1、試驗(yàn)臺(tái)2和位于試驗(yàn)臺(tái)2一側(cè)的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器，電腦1放置在試驗(yàn)臺(tái)2上表面，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器包括支撐框架14、保溫桶35和漏桶34，支撐框架14外型呈圓柱形，支撐框架14頂部外緣設(shè)有環(huán)形的連接法蘭40；

保溫桶35設(shè)在支撐框架14內(nèi)，保溫桶35包括上下通透的外桶體41和內(nèi)桶體42，外桶體41的中心線沿垂直方向設(shè)置，內(nèi)桶體42的半徑小于外桶體41的半徑，內(nèi)桶體42同軸線設(shè)置在外桶體41內(nèi)，外桶體41的底部與內(nèi)桶體42的底部之間固定設(shè)有環(huán)形的連接板43，外桶體41的內(nèi)壁與內(nèi)桶體42的外壁之間形成保溫腔室44，連接板43上設(shè)有位于保溫腔室44內(nèi)的電阻加熱器32，外桶體41頂部的外緣固定設(shè)有環(huán)形的外法蘭盤45，內(nèi)桶體42頂部的外緣固定設(shè)有環(huán)形的內(nèi)法蘭盤46，內(nèi)桶體42頂部的內(nèi)側(cè)壁上設(shè)有環(huán)形的臺(tái)階47；

內(nèi)桶體42內(nèi)滑動(dòng)密封連接有活塞24，活塞24的上表面上固定設(shè)有擾動(dòng)泵23，活塞24底部連接有電動(dòng)絲杠升降機(jī)25，活塞24上穿設(shè)有上端凸出于活塞24上表面的蒸汽接入管21，蒸汽接入管21上端設(shè)有頂部呈球形的端蓋48，端蓋48上設(shè)有通氣孔49，蒸汽接入管21上設(shè)有單向閥，活塞24上穿設(shè)有出料管26，出料管26下端設(shè)有位于活塞24下方的三通接頭17，三通接頭17的第二個(gè)接口通過(guò)水樣管30連接有水樣檢測(cè)儀15，三通接頭17的第三個(gè)接口通過(guò)廢液管31連接有廢液處理桶19，水樣管30上設(shè)有第三閥門16，廢液管31上設(shè)有第四閥門18，廢液處理桶19上設(shè)有水泵22；

漏桶34位于保溫桶35內(nèi)，漏桶34的頂部外緣設(shè)有環(huán)形的壓接板50，漏桶34底部開設(shè)有漏孔51，壓接板50位于內(nèi)桶體42頂部的臺(tái)階47上；

保溫桶35的外法蘭盤45設(shè)置在支撐框架14的連接法蘭40上，保溫桶35頂部設(shè)有蓋體27，蓋體27、外法蘭盤45和連接法蘭40之間穿設(shè)有外螺栓11，蓋體27與內(nèi)法蘭盤46之間穿設(shè)有內(nèi)螺栓12；

蓋體27頂面設(shè)有pH檢測(cè)儀8和壓力檢測(cè)儀11，蓋體27上穿設(shè)有下端伸入到內(nèi)桶體42內(nèi)的投料管4和循環(huán)進(jìn)料管5，投料管4上設(shè)有梯度加熱裝置6和第一閥門9，循環(huán)進(jìn)料管5上設(shè)有第二閥門7，蓋體27底面上設(shè)有位于漏桶34內(nèi)的溫度傳感器28和pH傳感器29，pH傳感器29通過(guò)信號(hào)線與pH檢測(cè)儀8連接，溫度傳感器28、pH檢測(cè)儀8和壓力檢測(cè)儀11分別通過(guò)信號(hào)線與電腦1連接；循環(huán)進(jìn)料管5的另一端與水泵22的出水口連接。

漏桶34的外壁上沿軸向方向開設(shè)有直線型的縫隙52。

漏桶34頂面與蓋體27底面之間設(shè)有橡膠密封圈。

原位修復(fù)富氮地?zé)崴Ч哪M實(shí)驗(yàn)裝置的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

（1）、制備與實(shí)際熱儲(chǔ)條件相似的模擬地?zé)崴畼?、介質(zhì)巖樣以及菌株；

（2）、檢查保溫桶是否漏水，接著采用蒸汽滅菌鍋對(duì)步驟（1）中制備的介質(zhì)巖樣進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為30min；

（3）、開始進(jìn)行修復(fù)富氮地?zé)崴哪M實(shí)驗(yàn)，對(duì)模擬反應(yīng)后的混合液進(jìn)行NO₃--N、NO₂--N、TN濃度檢測(cè)。

步驟（1）中模擬地?zé)崴畼拥呐渲品椒ㄊ牵簻囟葹?8 ℃，總活潑陽(yáng)離子為273.28 mg/L，總活潑陰離子為659.37 mg/L，總有機(jī)碳（TOC)為3.8 %，選取琥珀酸鈉2.36g、KNO₃0.361 g、KNO₂ 0.304g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、KH₂PO₄ 1.0g、K₂HPO₄ 5.0g、NaCl 0.5g和微量元素溶液，進(jìn)行混合并用取自現(xiàn)場(chǎng)的地?zé)崴ㄈ葜?000 mL的混合液，調(diào)節(jié)混合液的pH值為8.0；其中微量元素溶液的成分配比為：Na₂SeO₃ 0.005g，CoCl₂·6H₂O 0.1 g，NiCl₂ 0.05 g Na₂MoO₄ 0.005 g，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g，CaCl₂ 0.1 g，BaCl₂ 0.002g ，CuSO₄·5H₂O 0.01 g, MnSO₄·H₂O 0.5 g, FeSO₄ 0.02 g, MgSO₄·7H₂O 3 g，H₃BO₃ 0.01 g，NTA 1.5 g和水溶液混合。

步驟（1）介質(zhì)巖樣的制備的具體過(guò)程為：實(shí)驗(yàn)填充的巖樣采用擾動(dòng)細(xì)砂土，從距地表深度約60 m的巖層中采集巖樣，然后將采集的巖樣在室溫下自然風(fēng)干，然后去除巖樣中的雜質(zhì)，最后經(jīng)篩孔半徑為2 mm的篩網(wǎng)過(guò)濾后備用；

步驟（1）中菌株制備的具體方法包括以下步驟：

a、反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)：從實(shí)驗(yàn)所在地深地?zé)峋谐槿〕龅責(zé)崴?，接著量?0ml地?zé)崴鳛闃悠凡⒎湃氲?50ml的三角瓶中，然后向三角瓶中加入經(jīng)滅菌過(guò)的100ml的LB液體培養(yǎng)基，把三角瓶放置在溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為60 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待三角瓶中的培養(yǎng)液渾濁后，取出10ml的培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)接到滅菌后的液體反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中，之后每隔12h分別用二苯胺試劑和格利斯試劑定性檢測(cè)液體反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)液中NO₃^-和NO₂^-的含量，當(dāng)液體反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)液中的NO₃^-含量明顯下降且有NO₂^-產(chǎn)生時(shí)，取出10ml的培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)液中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，富集四代后備用；

b、反硝化細(xì)菌的分離純化：用十倍稀釋法，采用移液槍吸取100 μL菌懸液，加入900 μL無(wú)菌水中，充分混勻，此為10^-1倍稀釋液，以此類推逐步稀釋為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6菌懸液，分別取200 μL各梯度菌懸液用涂布棒均勻涂布于溴百里酚藍(lán)（BTB）培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)基上，然后將平板培養(yǎng)基倒置在溫度為35℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3d，之后用接種環(huán)挑取周圍出現(xiàn)藍(lán)色光暈的單菌落進(jìn)行分離，此為初篩菌株，將初篩菌株分別挑取接種于新鮮的平板培養(yǎng)基上，于35℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，再次挑取單菌落劃線分離，重復(fù)三次之后，將細(xì)胞涂片染色，用顯微鏡檢查菌株是否為單一菌種，若發(fā)現(xiàn)有雜菌，須再次重復(fù)分離、純化，直到獲得純菌落，把純化的菌株進(jìn)行編號(hào)，斜面培養(yǎng)后置4℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?/p>

c、反硝化性能測(cè)定：

在試管中加入10 mL反硝化性能測(cè)定培養(yǎng)液，并將德漢氏小管傾斜倒置放入試管底部，然后將步驟（b）中純化好的菌株經(jīng)平板劃線活化，然后用接種環(huán)挑接于培養(yǎng)液中，接著在溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為60 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)，定時(shí)觀察德漢氏小管中產(chǎn)氣速度的快慢和產(chǎn)氣量的多少，用以定量判定菌株反硝化性能的強(qiáng)弱，篩選出高效菌株，以備實(shí)驗(yàn)所用。

步驟（2）中檢查保溫桶35是否漏水的過(guò)程為：向保溫桶35的內(nèi)桶體42內(nèi)加入適量的水，檢查內(nèi)桶體42是否漏水，確認(rèn)不漏水后蓋上蓋體27，重新將外螺栓11和內(nèi)螺栓12擰緊；

巖樣的滅菌過(guò)程為：將制備的巖樣放入蒸汽滅菌鍋內(nèi)，經(jīng)蒸汽滅菌鍋滅菌30分鐘后，再將滅菌后的巖樣裝填在漏桶34內(nèi)。

步驟（3）的具體方法為：

Ⅰ、打開外螺栓11和內(nèi)螺栓12，取下蓋體27，首先將厚度為10μm的尼龍濾布放置在漏桶34的底部，然后依次向漏桶34內(nèi)填裝厚度為2cm的粗粒石英砂、土柱、2cm的粗粒石英砂；

Ⅱ、打開第一閥門9，通過(guò)操控電腦1控制電動(dòng)絲杠升降機(jī)25，以驅(qū)動(dòng)活塞24沿內(nèi)桶體42的內(nèi)壁向下運(yùn)動(dòng)，使保溫桶35的內(nèi)部空間達(dá)到最大，然后通過(guò)蒸汽接入管21向保溫桶35內(nèi)通入蒸汽，通入蒸汽時(shí)間為30分鐘，結(jié)束后關(guān)閉第一閥門9；

Ⅲ、通過(guò)電腦1設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度和投料溫度，啟動(dòng)電阻加熱器32和梯度加熱裝置6，當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度達(dá)到設(shè)定值后，打開第一閥門9，通過(guò)投料管4向保溫桶35內(nèi)注入接種反硝化菌A1的模擬地?zé)崴?，注入完畢后關(guān)閉第一閥門9，電腦1設(shè)定實(shí)驗(yàn)壓力，啟動(dòng)電動(dòng)絲杠升降機(jī)25，電動(dòng)絲杠升降機(jī)25驅(qū)動(dòng)活塞24移動(dòng)，使內(nèi)桶體42內(nèi)的氣壓達(dá)到設(shè)定壓力值后，再通過(guò)電腦1啟動(dòng)擾動(dòng)泵23；

Ⅳ、經(jīng)過(guò)K分鐘后，打開第三閥門16，將適量的保溫桶35內(nèi)的水樣通過(guò)水樣管30送至水樣檢測(cè)儀15，關(guān)閉第三閥門16，利用水樣檢測(cè)儀15檢測(cè)水樣中氮元素含量，然后電腦1記錄氮元素含量值，然后每隔K分鐘后，打開第三閥門16，采集水樣并分析水樣中的元素含量，電腦1記錄氮元素含量值，由此電腦1繪制出水樣中的氮含量隨時(shí)間變化的曲線圖；

Ⅴ、得出氮含量隨時(shí)間變化的關(guān)系圖后結(jié)束試驗(yàn)，打開第四閥門18和第二閥門7，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)后的模擬混合液流入到廢液處理桶19內(nèi)進(jìn)行處理，然后啟動(dòng)水泵22，將處理后的模擬混合液經(jīng)循環(huán)進(jìn)料管5再次注入到漏桶34內(nèi)循環(huán)利用。

以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。