專利名稱：：枳椇子提取物在抗衰老藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及枳模子的用途，尤其是涉及枳模子提取物在制備抗衰老藥物中的用途。
背景技術：
：衰老是一種自然現(xiàn)象，有關衰老機制的理論學說眾說不一，自1956年提出衰老的自由基理論以來，關于自由基與衰老關系的研究受到了重視，自由基學說認為引起人體衰老的主要原因是人體細胞代謝過程中不斷產生的自由基，因其具有高度的化學活性，能與活細胞的大部分發(fā)生反應，損傷DNA分子，造成鍵的斷裂，使細胞死亡或發(fā)生突變。許多因素如紫外線、X射線、y射線、香煙煙霧、氧化性環(huán)境污染物、電離子輻射、過度用腦、參加強體力運動，以及在短時間缺氧環(huán)境中生活等都會誘發(fā)正常代謝以外的自由基的產生，而人類年齡大于50歲時，體內的抗氧化酶活性開始下降，大于60歲，下降更明顯，使體內產生過多的自由基超過了細胞抗氧化防御能力，無法及時清除，過多的自由基可造成機體內的DNA、蛋白質和脂類的損傷，損傷的累積導致細胞的衰老或死亡。衰老的自由基機制提示，提高體內抗氧化酶活性或減少體內生成的過多的自由基將有助于防治衰老相關性疾病。目前人口正趨于老年化，衰老以及越來越多的與衰老相關的疾病正在嚴重影響老年人的生活質量。因此，開發(fā)一種能延緩衰老、預防衰老相關疾病的發(fā)生而又無明顯副作用的藥物將具有很大的社會意義。枳模子(5^z朋A^e/7ise)為鼠李科(yAa咖sc朋e)拐麥屬(7力朋扮植物枳模(^brayw'atWcis7T朋扮的干燥成熟種子，有較高的藥用價值，有實驗顯示枳模子中含多種黃酮類物質，具有較強的抗氧化活性。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種枳模子提取物在制備抗衰老藥物中的應用。枳模子，為鼠李科(Rhamnaceae)拐棗屬(HoveniaThunb)植物枳模的千燥成熟果實及肉質花序柄。枳模全世界有3種3變種，分布于中國、日本、朝鮮和印度等國，我國有3種2變種，其根、枝、葉、果實、種子都可以入藥，主治酒毒、煩熱、口渴、嘔吐、二便不利等癥。枳模子通過乙醇常規(guī)工藝提取取枳榥子一次性過粉碎機，破碎成粗粉，粗粉置提取罐內加4倍量75%乙醇回流煮提3次，每次2小時，溫度80。C左右，提取液合并后過400目篩并減壓濃縮至膏狀(45。C時，測定相對密度1.301.35)，真空干燥。本發(fā)明枳棋子提取物能減少衰老小鼠肝臟及腦組織內MDA的生成，提高肝臟和腦內GSH-Px和S0D活性，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明枳模子既能減輕組織或細胞的過氧化損傷，減少脂質過氧化物的形成，又能增加體內抗氧化酶的活性以增加對自由基損傷的防御功能，枳模子可通過自由基代謝發(fā)揮其抗衰老作用。具體實施例方式實施例1材料與方法1.1藥物與試劑枳模子，北京同仁堂(亳州)飲片有限公司，批號601000024;f半乳糖(AMRESCO公司)；維生素E(MERCK公司)；超氧歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品，批號分別為20070414、20070417、20070418。羧甲基纖維素(CMC)(sigma公司)1.2儀器SF-300型高速粉碎機，上海中聯(lián)制藥裝備有限公司；IOO型多功能中藥提取罐，武漢制藥機械廠；SMG-2型程控水迷宮，中國醫(yī)學科學院藥物研究所；DY89-II型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；752紫外光柵分光光度計。上海第三分析儀器廠；低溫離心機，上海安亭科學儀器廠。1.3枳模子提取物制備取枳模子一次性過粉碎機，破碎成粗粉，粗粉置提取罐內加4倍量75%乙醇回流煮提3次，每次2小時，溫度8(TC左右，提取液合并后過400目篩并減壓濃縮至膏狀(45。C時，測定相對密度1.301.35)，真空干燥。以蘆丁為對照品，在500nm處，以紫外分光光度計測得枳模子中總黃酮含量為(2.57±0.04)%。1.4實驗動物NIH小鼠，體重2730g，雌性，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號2006A045。1.5實驗方法1.5.1亞急性衰老小鼠模型的制備及給藥60只小鼠隨機分為空白對照組、模型組、給藥組、陽性對照組。空白組注射無菌生理鹽水，其他各組每天頸背部皮下注射D-半乳糖100mg/kg，同時，給藥組分別灌服枳模子提取物50mg.kg—!、100mg.kg-1、200mg.kg—、(分別相當于生藥0.35g/kg、0.70g/kg、L40g/kg)陽性對照組灌以維生素E200mg.kg—、枳模子提取物及維生素E均用1%CMC配制，空白組和模型組灌以等體積P/。CMC。每日l次，連續(xù)45天。1.5.2小鼠水迷宮實驗水迷宮由黑色有機玻璃板組成，共有4個盲端及ABC三個入水點，終點區(qū)有一高出水面的安全平臺，ABC入水點與平臺的距離依次增大，即C點距平臺最遠，水深13cm，水溫(23土1)°C，訓練進行3天，平臺周圍設置標志物，訓練前先將小鼠置平臺10s，使其熟悉周圍環(huán)境，第一天將小鼠放入A入水點，讓其自由尋找平臺，第二天放入B入水點，操作同前，第三天放入C入水點，訓練中如小鼠在240s內未能找到平臺，則將其引導上平臺，第四天進行實驗，將小鼠置C入水點，記錄其游至平臺的時間為潛伏期，超過240s則以240s計。其進入盲端的次數(shù)為錯誤次數(shù)，以潛伏期和錯誤次數(shù)作為小鼠學習記憶的成績。1.5.3各組織SOD、MDA、GSH-Px含量測定水迷宮實驗結束后，斷頸處死各組小鼠，迅速取其大腦及肝臟，沐水浴中制成10%勻漿，4'C離心取上清，備用。SOD、MDA、GSH-Px含量測定按試劑盒說明書進行。蛋白定量采用考馬斯亮蘭法。1.5.4統(tǒng)計學方法結果用x土s表示，采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。2實驗結果及分析2.1小鼠水迷宮實驗與正常對照比較，小鼠連續(xù)給予"-半乳糖45d后，模型組小鼠到達平臺的時間顯著延長，進入盲端的次數(shù)顯著增多，說明造模成功；與模型組比較，各給藥組能顯著縮短小鼠到達平臺的時間，減少進入盲端的次數(shù),低劑量組略好于高、中劑量。陽性對照組也有同樣的效應(表l)。實驗結果提示枳模子能明顯改善^-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力。表l:各組小鼠行為學實驗結果."=10，X±s<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"代O.01,y/K0.05，與模型組比較；3)i<0.01，與對照組比較2.2枳模子提取物對衰老小鼠肝、腦組織中丙二醛含量，超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響與正常對照組小鼠相比，D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腦組織中MDA含量明顯升高，S0D及GSH-Px活性均顯著下降，枳模子各給藥組能劑量依賴性地降低肝、腦組織中MDA的含量，提高S0D及GSH-Px的活性(表2，表3)。表2.枳棋子提取物對衰老小鼠肝臟中MDA含量，SOD及GSH-Px活性的影響."=10，x±s<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"代0.01，2)/^0.05，與模型組比較；3)代O.Ol,與對照組比較表3.枳模子提取物對衰老小鼠腦組織中MDA含量，S0D及GSH-Px活性的影響."=10，x±sGroupDose/mg.kg一1SOD/U.mgprot—1MDAnmol.mg—1GS.H-PxU.mgprot-1Normal172±54')1.8±0.3n95±49"Model100106±263)4.8±0.9"51±123)Vit柳ineE200210士42"2.9±0.7n86±292'r力w"650185士441)3.3±0.7"83±222)100176士70"2.8±0.91)91±40"200198±69"2,1±0.6n92±32"注')代0.01，2)代0.05，與模型組比較；3)代O.Ol，與對照組比較正常情況下機體的自由基產生與消除處于平衡狀態(tài)，隨著年齡的增加，由于抗氧化酶活力的不斷下降，體內產生的過量自由基無法得到及時清除，過剩的自由基可誘發(fā)動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等多種疾病，也是加速機體衰老的重要因素之一。與此同時，機體的免疫系統(tǒng)功能也逐漸衰退，降低機體的防御能力，從而加速衰老過程，由于氧自由基與脂質過氧化及衰老的發(fā)生密切相關，因此，尋求改善自由基、抗氧化平衡的藥物成為延緩衰老和防治慢性疾病的重要方向。在一定時間內連續(xù)給小鼠注射D-半乳糖是人造小鼠衰老模型的經典方法。機體內半乳糖濃度升高，在醛糖還原酶作用下，還原成半乳糖醇，這種物質不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹，代謝紊亂，破壞機體抗氧化防御系統(tǒng)，使自由基聚集，同時在半乳糖被還原成半乳糖醇的過程中也產生與氧陰離子，使細胞膜受損，過氧化物脂質增加，出現(xiàn)衰老。有研究顯示造模時給予半乳糖的量超過100mg.kg—i時，其學習記憶的能力不再隨劑量的增加而減退，故本實驗中將半乳糖的量定為100mg.kg—、MDA是脂質過氧化的產物，其高低間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度；SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免收損傷；GSH-Px是機體內一種重要的催化過氧化氫分解的酶，其特異的催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應，可以保護細胞膜結構和功能完整的作用。實驗中，因給藥時間長，機體逐漸老化，功能狀態(tài)漸差，因此，注射給藥時應注意無菌操作；另外，因雄性小鼠長期群居，好咬斗易造成受傷而影響實驗結果，故選用雌性小鼠。本實驗結果顯示，模型組小鼠的學習記憶能力明顯低于空白組及陽性對照組，與模型組比較，枳棋子提取物組均能顯著改善衰老小鼠的學習記憶能力。低劑量小鼠學習記憶成績略優(yōu)于高、中劑量，但S0D、GSH-Px、MDA測定結果均有一定的劑量關系，這可能與行為學實驗的個體差異性有關；同時，結果顯示枳模子提取物能減少肝臟及腦組織內MDA的生成，提高GSH-Px和S0D活性，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明枳模子既能減輕組織或細胞的過氧化損傷，減少脂質過氧化物的形成，又能增加體內抗氧化酶的活性以增加對自由基損傷的防御功能，枳模子可通過自由基代謝發(fā)揮其抗衰老作用。權利要求1、枳椇子乙醇提取物在制備治療抗衰老藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了枳椇子乙醇提取物在制備治療抗衰老藥物中的應用。所述的枳椇子乙醇提取物能減少衰老小鼠肝臟及腦組織內MDA的生成，提高肝臟和腦內GSH-Px和SOD活性，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明枳椇子既能減輕組織或細胞的過氧化損傷，減少脂質過氧化物的形成，又能增加體內抗氧化酶的活性以增加對自由基損傷的防御功能，且枳椇子可通過自由基代謝發(fā)揮其抗衰老作用。文檔編號A61K36/72GK101185688SQ20071003135公開日2008年5月28日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權日2007年11月13日發(fā)明者徐江平,江海濤,程玉芳申請人:南方醫(yī)科大學