解角質素微桿菌及其培養(yǎng)方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為一株解角質素微桿菌（ Microbacteriumkeratanolyticum ）Mk-6菌株，環(huán)境適應能力強，可以在低營養(yǎng)、磷濃度為14.9mg/L（達到0.2mg/L將會致使水體富營養(yǎng)化）的合成污水液體培養(yǎng)基中快速生長，并將磷去除；除磷效率高而穩(wěn)定，培養(yǎng)20h磷效率可達60%~70%，無二次污染。因此，Mk-6菌株可應用于含磷的污水處理，是水體生物除磷工藝上重要的微生物資源，具有良好的應用前景。CCTCC NO:M20142792014.06.24
【專利說明】解角質素微桿菌及其培養(yǎng)方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領域，具體涉及一株解角質素微桿菌(#icrc^ac i Mk-6菌株的分離、培養(yǎng)及其在污水除磷中的應用。

【背景技術】
[0002] 磷是生物生長的必需元素之一,但是水體中磷含量超過0. 2 mg/L將會致使水體富 營養(yǎng)化，導致水質降低，水體中的有害物質增加，飲用水資源減少，對人畜的健康造成影響， 破壞生態(tài)系統(tǒng)的平衡，造成經濟損失。就2013年中國環(huán)境狀況公報顯示，松花江、海河、太 湖、巢湖、滇池等水域，均因總磷等指標的超標，多年來處于富營養(yǎng)化狀態(tài)。因此，控制工業(yè) 廢水、生活污水磷含量已經成為急切需要解決的重大環(huán)境問題之一。
[0003] 目前，水體除磷主要分為生物和化學除磷?；瘜W除磷具有操作簡單、高效除磷、穩(wěn) 定等優(yōu)點；但該法成本高，易造成二次污染。生物除磷是利用聚磷菌富集水體中的磷，通過 排除剩余含磷污泥的方式除磷，具有節(jié)能、產泥量少、成本低、無二次污染等優(yōu)點，是大規(guī)模 污水處理廠主要的污水除磷方法。
[0004] 聚磷菌是一類具有"超量吸磷"特征的微生物，可以把多余的磷以多聚磷酸鹽的形 式儲藏在體內，使外界環(huán)境中的磷含量顯著減少，是水體生物除磷的主要執(zhí)行者，在生物除 憐中起決定性作用。
[0005] 實驗室運用低營養(yǎng)合成污水液體培養(yǎng)基(磷含量為14. 9 mg/L)檢測菌株水體除磷 能力，篩選具有高效除磷能力的聚磷菌。合成污水液體培養(yǎng)基磷濃度是致水體富營養(yǎng)化最 低磷濃度（〇. 2 mg/L)的74. 5倍，通過低營養(yǎng)超高磷濃度合成污水液體培養(yǎng)基篩選得到的 聚磷菌，能夠較好的適應自然水體環(huán)境，且更高效的去除自然水體中的磷。
[0006] 本發(fā)明從自然生境中篩到一株高效生物除磷特性的聚磷菌解角質素微桿菌 (#icrc^aci6?ri應左<9，<3(<3/?〇7，?^應）]\&-6菌株，旨在豐富的聚磷菌資源,擴大聚磷菌菌種 庫，為污水生物除磷提供菌種。


【發(fā)明內容】

[0007] 為了解決上述的技術問題，本發(fā)明的第一個目的是提供一株解角質素微桿菌 (#/<^，0辦<3<^6?/^應左(9， <3(<3/7〇7，?^應)]\&-6菌株,該菌株除磷效率高而穩(wěn)定。本發(fā)明的第二 個目的是提供上述的菌株的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的第二個目的是提供上述的菌株的應用。
[0008] 為了實現上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案： 解角質素微桿菌(ift'croAacieriiffl? 菌株，該菌株保藏在位于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏日期為2014年06月24日，保藏編號為：CCTCC Ν0:Μ 2014279，保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。
[0009] 本發(fā)明所涉及的菌株篩選自浙江省金華市市郊池塘的水體樣品。采用梯度稀釋法 獲得純菌株，根據形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列鑒定Mk-6菌株為解角質素 '傲妖麗、Microbacterium keratanolyticum)。
[0010] 為了實現上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案： 上述的解角質素微桿菌Mk-6菌株的培養(yǎng)方法，該方法包括以下的步驟：取保存 于-20°C的甘油的解角質素微桿菌Mk_6菌株20 μ L涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平 板上，28 °C培養(yǎng)24 h后挑單菌落于0.3 mL無菌水混勻，取100 yL涂布于牛肉膏蛋白胨 固體培養(yǎng)基的平板上，用打孔器取2孔接到15 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于28 °C， 170 r/min搖床中培養(yǎng)24 h用作種子液。
[0011] 為了實現上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案： 上述的解角質素微桿菌Mk-6菌株用于除磷。優(yōu)選用于城市污水處理廠的生物除磷。
[0012] 本發(fā)明為一株解角質素微桿菌菌株，環(huán) 境適應能力強，可以在低營養(yǎng)、磷濃度為14. 9 mg/L (達到0.2 mg/L將會致使水體富營養(yǎng) 化）的合成污水液體培養(yǎng)基中快速生長，并將磷去除；除磷效率高而穩(wěn)定，培養(yǎng)20 h磷效率 可達609Γ70%，無二次污染。因此，Mk-6菌株可應用于含磷的污水處理，是水體生物除磷工 藝上重要的微生物資源，具有良好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖I Mk-6菌株的菌落特征。
[0014] 圖2 Mk-6菌株的菌體形態(tài)（X 1000)。
[0015] 圖3 Mk-6菌株16S rDNA基因序列。
[0016] 圖4基于16s rDNA基因序列建立的微桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0017] 圖5 Mk-6菌株在低營養(yǎng)高磷合成污水培養(yǎng)液中的生長曲線。
[0018] 圖6裝液量對Mk-6菌株除磷率的影響。

【具體實施方式】
[0019] 實施例1高效聚磷菌解角質素微桿菌Mk-6菌株的分離篩選和鑒定 (一）培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7. (Γ7. 2 (液體培養(yǎng)基不加瓊脂)，用于細菌的分離、純化。
[0020] 限磷(富磷）固體培養(yǎng)基：取30 mL去離子水溶解8. 372 g 3-嗎啉丙磺酸、0. 717g N-三(羥甲基）甲基甘氨酸，用10 mol/L的KOH調節(jié)pH至7. 4,按下列順序加溶液：0.01 mL 1.830% FeSO4溶液（現配）、5 mL 1.9 mol/L NH4C1、1 mL 0.276 mol/L K2S04、0.025 mL 0.02 mol/L CaCl2 · 2Η20、0· 42 mL I. 25 mol/L MgCl2 · 6 H20、20 mL 2· 5 mol/L NaCl、0. 02 mL 微量元素混合液(七鑰酸銨 3 X 10_6 mol/L、H3BO3 4X 10_4 mol/L、CoCl2 3 X 10_5 mol/L、CuSO4 10 5 mol/L、MnCl2 8 X 10 5 mol/L、ZnSO4 10 5 mol/L)、10 mL 1% 葡萄糖、0.4 mL I. 686% 維生 素 Bl、250 yL 6. 928% K2HPO4 (富磷加5 mL)、50 mg對甲苯胺藍，加水定容至500 mL，過濾 除菌后與已滅菌處理的溶有20 g瓊脂且未凝固的500 mL溶液混勻制成固體培養(yǎng)基，用于 聚磷菌的篩選。
[0021] (二）方法 采用梯度稀釋分離法。取水樣I mL，加9 mL無菌水稀釋，進行KT1^r3梯度稀釋，取 10_2、10_3稀釋液100 μ L涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，28 °C培養(yǎng)24 h。挑取 細菌單菌落，進行分離、純化；進一步純化菌株采用劃線法，所得純菌株置-20 °C冰箱中保 存，備用。
[0022] 分別接種保存的細菌純菌株在限磷和富磷固體培養(yǎng)基上，用呂氏美蘭染色法、蘇 丹黑染色法、藍白斑法和鑰酸銨分光光度法測定細菌菌株對磷的吸收能力，經初篩和復篩 后獲一株編號為Mk-6高效吸磷的細菌菌株(附圖2)。
[0023] 對Mk-6菌株進行形態(tài)學、生理生化和16S r DNA序列鑒定。
[0024] (三）結果 Mk-6菌株的形態(tài)特征：菌落圓形、黃色、邊緣完齊、隆起、光滑、粘稠、濕潤、半透明（附 圖1);菌體呈短小桿狀，革蘭氏染色呈陰性，有鞭毛，無芽孢(附圖2)。
[0025] Mk-6菌株的生理生化特征：Mk_6菌株淀粉水解、吲哚、硫化氫和L-精氨酸脫羧酶 試驗均呈陽性，不能利用檸檬酸鹽，不液化明膠，VP、甲基紅、葡萄糖發(fā)酵、硝酸鹽還原試驗 均為陰性(表1);菌株生長溫度范圍為15 °C~40 °C，最適生長溫度為25 °C~28 °C，適宜 生長 pH 為 7. (T9. 0。
[0026] Mk-6菌株16S rDNA基因序列（附圖3) :16S rDNA基因測序分析結果表明，其堿 基序列全長為1422 bp，運用在線Blast軟件進行同源性分析，選取19株微桿菌屬的菌株 構建系統(tǒng)發(fā)育樹（附圖4)。由圖4顯示，Mk-6菌株與解角質素微桿菌 左在進化樹的同一支上，兩菌株同源性最高達98%。結合菌株形態(tài)特征、生 理生化特征，鑒定該菌株為解角質素微桿菌
[0027] 表I Mk-6菌株的生理生化試驗結果

【權利要求】
1. 解角質素微桿菌dicroAacieritt? 菌株，該菌株保藏在位 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏日期為2014年06月24日，保藏編號為：CCTCC N0:M 2014279,保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。
2. 權利要求1所述的解角質素微桿菌Mk-6菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括以 下的步驟：取保存于_20°C的甘油的解角質素微桿菌Mk-6菌株20 μ L涂布于牛肉膏蛋白 胨固體培養(yǎng)基的平板上，28 °C培養(yǎng)24 h后挑單菌落于0.3 mL無菌水混勻，取100 μ L涂 布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板上，用打孔器取2孔接到15 mL牛肉膏蛋白胨液體培 養(yǎng)基中，置于28 °C，170 r/min搖床中培養(yǎng)24 h用作種子液。
3. 權利要求1所述的解角質素微桿菌Mk-6菌株用于除磷。
4. 權利要求1所述的解角質素微桿菌Mk-6菌株用于城市污水處理廠的生物除磷。
【文檔編號】C02F3/34GK104277996SQ201410348045
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權日:2014年7月21日
【發(fā)明者】蔣冬花, 謝祥聰, 胡優(yōu), 李曉倩 申請人:浙江師范大學