一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法
【專利摘要】一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法屬于水質(zhì)凈化及環(huán)境保護【技術(shù)領(lǐng)域】。按照以下步驟進行：(1)菌種活化：從斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)類芽孢桿菌(Paenibacillus?sp.)CGMCC?No.2040菌苔接種于液體培養(yǎng)基中活化；(2)發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的菌液按1％～2％體積比接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)36～96h，得到菌株發(fā)酵液；(3)取適當菌株發(fā)酵液加入到重金屬溶液中，調(diào)節(jié)pH為3～7，在溫度為20～30℃搖床反應10～90min，使水中重金屬被充分吸收；后離心取上清液，等離子體發(fā)射光譜儀法測定溶液中的重金屬離子濃度。本發(fā)明方法中去除水中重金屬離子過程中操作簡單，成本低廉，無污染，具有較好的推廣應用價值，其對蓄電池生產(chǎn)廢水中鉛離子的去除率達到94％以上。
【專利說明】一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水質(zhì)凈化及環(huán)境保護【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]重金屬廢水是一種對生態(tài)環(huán)境危害極大的工業(yè)廢水，主要來源于采礦、選礦、冶煉、電鍍、化工、制革和造紙工業(yè)，這些工業(yè)產(chǎn)生的含汞、鉻、鎘、鎳、銅、鉛等重金屬廢水具有較大的毒性。含重金屬的廢水排放到水體中，在藻類和底泥中積累，被魚和貝類經(jīng)體表吸附與體內(nèi)吸收，產(chǎn)生食物鏈濃縮，對人類健康和生態(tài)環(huán)境的危害越來越嚴重，因此有效地從工業(yè)廢水中去除重金屬已經(jīng)成為環(huán)保領(lǐng)域十分迫切的任務。
[0003]目前應用于重金屬離子污染水體的方法有化學處理、離子交換、吸附法、膜分離等等，但都存在一定的弊端。化學處理通過沉淀、氧化還原、絮凝作用等有效去除重金屬，但投入化學藥劑成本及運行成本較高，且造成二次污染；離子交換法操作繁瑣，運行費用較高；吸附和膜分離法同樣存在運行成本高等問題。因此需要探索一種高效且價格低廉的處理方法。
[0004]近幾年來，微生物對金屬的結(jié)合能力即利用微生物從水溶液中富集、脫除重金屬離子的方法一生物吸附法，引起了研究人員的注意。該方法不僅可在有效脫除有毒金屬的同時不引入其它有害物質(zhì)，而且它在mg/L級的廢水處理中具有獨特優(yōu)勢，進而彌補了現(xiàn)有工藝的不足。生物處理是一種新興的重金屬污染處理技術(shù)，通過生物吸附劑的絡(luò)合、螯合、離子交換、吸附、絮凝等生化作用將重金屬離子吸附于生物細胞之中，以達到消除重金屬污染的目的，因且其具有成本低、選擇性強、處理效率高、無二次污染等優(yōu)點，在重金屬污染處理方面有著廣泛研究和應用前景。
[0005]生物吸附的研究國內(nèi)外多處于實驗室研究階段，采用人工模擬廢水，探索各種微生物對不同重金屬的吸附特性和規(guī)律，研究的主要注意力集中在細胞壁對金屬離子的吸附過程上，并揭示了細胞內(nèi)部對金屬離子也有吸附作用。一般來說，金屬的生物吸附是以許多金屬結(jié)合機理為基礎(chǔ)的。這些機理可以是單獨起作用的，也可以與其他機理結(jié)合在一起起作用，這取決于過程的條件和環(huán)境。
[0006]目前國內(nèi) 外報道的文獻及所公開的專利中，利用微生物去除水中重金屬離子的生物吸附法應用較多，涉及的微生物主要有細菌、酵母菌、藻類和霉菌等對重金屬的吸附，但是對細菌及其代謝產(chǎn)物——胞外多糖去除廢水中的重金屬研究比較少。利用微生物絮凝劑(Microbial flocculant MBF)對廢水中的重金屬進行處理,是近年來研究的熱點。Friedman 和 Dugan 于 1968 年報道了 Zoogleoall5 產(chǎn)生的絮凝劑對 Co2+、Cu2+、Fe3+ 和 Ni2+有去除作用。其后各國研究者陸續(xù)報道了各種微生物所產(chǎn)生的生物大分子對金屬離子的處理作用，其研究結(jié)果均存在絮凝劑投加量較大，處理效率不理想等現(xiàn)象。如王競等(2001年)利用胞外高聚物產(chǎn)生菌(Paenibacillus sp.)GX4-1的發(fā)酵液制成的絮凝劑WJ-1對水中Cr(VI)進行絮凝吸附去除研究，當pH = 1.5，絮凝劑投放量為40-50!^的條件下，對Cr(VI)濃度為200mg/L，此時去除率為51%。郭帥(2008年)利用絮凝劑產(chǎn)生菌動膠菌屬(Zoogloea sp.)B2對重金屬pb2+的處理研究表明:在最佳pH值6.0條件下,投加量為30mL時，最大去除效率為68.72%。姚敏杰等(2009年)研究膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)產(chǎn)生的微生物絮凝劑(MBF)對高濃度重金屬離子模擬廢水的絮凝作用。將IOmL MBF分別加入到IOOmL含F(xiàn)e3+、Al3+、pb2+、Zn2+、Ca2+和Mg2+的模擬廢水中，去處理率均小于80%。宋京津(2011年)等利用微生物絮凝劑產(chǎn)生菌113產(chǎn)生的絮凝劑MBF 113對含重金屬Cd2+溶液去除的最佳pH值為7.0，投加量為20mL，處理20min時，可達到最大去除效率為68.2%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對以上不足，本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、綠色、高效且廉價的去除水中重金屬離子的方法，不僅可在常溫條件下去除大部分重金屬離子，去除效率高，均大于90%，而且培育操作過程簡單，用量低，投加量僅為0.1% (v/v)，價格低廉，較易推廣應用。
[0008]一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法，按照以下步驟進行:
[0009](I)菌株活化:從斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)CGMCCN0.2040菌苔接種于液體培養(yǎng)基中，在25~35°C溫度下以轉(zhuǎn)速為120~160r/min的搖床振蕩培養(yǎng)18~24h即可完成活化；
[0010](2)發(fā)酵培養(yǎng):將活化后的菌液按1%~2%體積比接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)36~96h，得到菌株發(fā)酵液；
[0011](3)取適當菌株發(fā)酵液加入到濃度為I~120mg/L的重金屬溶液中，使菌種發(fā)酵液與重金屬溶液的體積比為(I~10)%: 1，調(diào)節(jié)pH為3~7，在溫度為20~30°C搖床以轉(zhuǎn)速為140~180r/min條件下反應10~90min，使水中重金屬被充分吸收；后5000~10000r/min離心分離5~IOmin后取上清液,等離子體發(fā)射光譜儀法測定溶液中的重金屬尚子濃度。
[0012]將步驟(2)制備的菌株發(fā)酵液制成絮凝劑制品，利用絮凝劑制品去除水中重金屬離子的方法，按照以下步驟進行:
[0013](I)絮凝劑制品的制備:將步驟(2)制備的菌株發(fā)酵液稀釋后3~10倍離心分離，經(jīng)蒸發(fā)濃縮、加入75~95%的乙醇，乙醇的體積與發(fā)酵液的體積比為1: (2~5)，獲得絮凝沉淀物，取沉淀物經(jīng)離心分離和真空干燥制備成絮凝劑制品；
[0014](2)取適當絮凝劑制品加入到濃度為I~120mg/L的重金屬溶液中，使絮凝劑制品的質(zhì)量與重金屬溶液的體積比為(I~10)%克/升，調(diào)節(jié)pH為3~7，在溫度為20~30°C搖床以轉(zhuǎn)速為140~180r/min條件下反應10~90min，使水中重金屬被充分吸收；后5000~10000r/min離心分離5~IOmin后取上清液，等離子體發(fā)射光譜儀法測定溶液中的
重金屬離子濃度。
[0015]所述斜面培養(yǎng)基成分為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，瓊脂20g/L，pH =
7,分裝入試管，121°C下高壓滅菌30min，制成斜面。
[0016]所述液體培養(yǎng)基成分為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，pH7，121°C下高壓滅菌30min。
[0017]所述優(yōu)化培養(yǎng)基成分為:可溶性淀粉15g/L，酵母膏3g/L，K2HP046g/L,MgSO4.7Η200.2g/L, NaCl0.lg/L, pH8，在 121°C下高壓滅菌 30min。
[0018]所述重金屬溶液為含銅離子、鋅離子、鎳離子或鉛離子的重金屬離子的溶液，或者含重金屬鉛離子的蓄電池生產(chǎn)廢水。
[0019]本發(fā)明方法中去除水中重金屬離子過程中操作簡單，成本低廉，無污染，具有較好的推廣應用價值，其對蓄電池生產(chǎn)廢水中鉛離子的去除率達到94%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040發(fā)酵液對不同濃度重金屬鉛離子的去除作用效果圖。
[0021]圖2類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040發(fā)酵液對不同濃度重金屬銅離子的去除作用效果圖。
[0022]圖3類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040發(fā)酵液對不同濃度重金屬鋅離子的去除作用效果圖。
[0023]圖4類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)CGMCC N0.2040發(fā)酵液對不同濃度重金屬鎳離子的去除作用效果圖。
[0024]圖5類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040發(fā)酵液處理含鉛廢水前的掃描電鏡顯微圖片。
[0025]圖6類芽抱桿菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040發(fā)酵液對含5mg/L鉛離子廢水處理后的掃描電鏡顯微圖片
[0026]圖7 類芽抱桿菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040 發(fā)酵液對含 50mg/L 鉛離子廢水處理后的掃描電鏡顯微圖片。
圖8本發(fā)明【具體實施方式】中16S rRNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，進行序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，其中UserSeq即為本發(fā)明所述菌株。
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明產(chǎn)絮菌株經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號:CGMCC N0.2040，分類命名:類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，保藏日期:2007年5月11日。
[0028]本發(fā)明實施例中產(chǎn)絮菌株制備的方法，在果樹種植、栽培土壤或公園草坪土壤距地表約2-5cm處土樣中分離得到的野生菌種經(jīng)梯度稀釋涂布平板法篩選、純化所得，按照如下步驟進行:
[0029](I)稱取果樹種植、栽培土壤或公園草坪土壤距地表約2-5cm土壤樣品l_10g放到滅菌的250mL三角燒瓶中，添加無菌水使最終體積為IOOmL,加塞后放入30°C，150r/min搖床中震蕩培養(yǎng)24h ；
[0030](2)靜置約20-40min，用移液槍吸取ImL上清液注入裝有9mL無菌水的試管中充分混合均勻后，換槍頭再從此試管中吸取ImL溶液注入另一支裝有9mL無菌水的試管中，依次制得ICT1~10_5稀釋梯度的土壤懸液；
[0031](3)在無菌操作臺上，用移液槍分別移取10-1，10-3, 10-5的土壤懸液各0.1mL置入在3個PBA培養(yǎng)基上，再用無菌涂布棒涂布均勻；把制備好的PBA培養(yǎng)基貼上標簽倒置在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d，選擇表面光滑且?guī)д承缘膯尉湓偻ㄟ^多次在PBA培養(yǎng)基上進行劃線分離后得到純菌落。
[0032]所述PBA培養(yǎng)基成分為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，瓊脂20g/L，pH7，121°C下高壓滅菌30min。此培養(yǎng)基用來篩選、分離菌種。
[0033]絮凝活性測定方法為:①初篩:在試管中裝入濃度為5g/L的高嶺土懸濁液20mL (把I改為L,以下同)，加入2~3滴培養(yǎng)后的微生物發(fā)酵液,震蕩、搖勻、靜置5min,觀察絮團生成情況，將有絮團生成的細菌作為微生物絮凝劑產(chǎn)生菌進行培養(yǎng)。將獲得的具有絮凝效果的細菌菌株，采用平板劃線法對所培養(yǎng)的細菌菌株進行分離和純化，獲得純菌株，并進行絮凝活性測定；②復篩:在IOOmL量筒中加入0.5g高嶺土，加IOOmL水搖勻后，制備成高嶺土懸浮液，加入0.1mL初篩后的微生物發(fā)酵液，搖勻后靜置5min，取50mL處上清液采用分光光度計測定其光密度OD55tl,以不加微生物發(fā)酵液的高嶺土懸浮液作為對比，計算絮凝率；③確定高效產(chǎn)絮菌株:篩選絮凝活性最強菌株經(jīng)培養(yǎng)的發(fā)酵液與高嶺土懸濁液以
0.1% (v/v)比例混合絮凝，其絮凝率為95.47%;④將此菌株保存于斜面培養(yǎng)基，置于冰箱保存。
[0034]本發(fā)明菌株鑒定:
[0035]①16S rRNA基因的PCR擴增:將篩選出的菌株用上海生工公司的細菌基因組DNA抽提試劑盒提取其基因組DNA。以基因組DNA為模板進行PCR擴增反應。擴增引物為:27F:5’ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3M541R:5’ -AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’。
[0036]16S rRNA 反應體系為 100 μ 1:Taq (5U/μ I) 0.8 μ I ; 10 X PCRBuffer (Mg2+Plus) 10 μ I ；dNTP Mixture (2.5mM/each) 8 μ I ；模板 DNA2.5ng ;引物27F(10ymol/L)2y 1，引物 1541R (10ymol/L)2y I ;ddH20 補足到 100 μ I。
[0037]PCR擴增條件:95 V預變性5min ；95 V變性lmin，57 °C退火lmin，72 V延伸lmin20s，運行共30循環(huán)；72°C最終延伸5min。
[0038]②瓊脂糖凝膠電泳:
[0039]PCR擴增產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠上進行電泳。其條帶在1500bp左右。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，測得16S rNA序列為1426bp。其序列測定結(jié)果如下:
[0040]TTCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCMTTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGATCGGCTTTTTAGGATTCGCTCCACCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTACCGACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTGCTTAGAGTGCCCACCATCATGTGCTGGCAACTAAGCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTTGAATGTTCCGAAGAAAAGGTACATCTCTGCACCGGTCATTCAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCATCCAGTTTCCGATGCGACCCGAAGTTGAGCTTCGGGATTAAACACCAGACTTAAATGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCA
【權(quán)利要求】
1.一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法，其特征在于按照以下步驟進行: (1)菌株活化:從斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)類芽孢桿菌Paenibacillussp.CGMCC N0.2040菌苔接種于液體培養(yǎng)基中，在25~35°C溫度下以轉(zhuǎn)速為120~160r/min的搖床振蕩培養(yǎng)18~24h即可完成活化； (2)發(fā)酵培養(yǎng):將活化后的菌液按1%~2%體積比接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)36~96h，得到菌株發(fā)酵液； (3)取適當菌株發(fā)酵液加入到濃度為1~120mg/L的重金屬溶液中，使發(fā)酵液與重金屬溶液的體積比為(1~10)%: 1，調(diào)節(jié)pH為3~7，在溫度為20~30°C搖床以轉(zhuǎn)速為140~180r/min條件下反應10~90min，使水中重金屬被充分吸收；后5000~10000r/min離心分離5~1Omin后取上清液，等離子體發(fā)射光譜儀法測定溶液中的重金屬離子濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法，其特征在于所于將步驟(2)制備的菌株發(fā)酵液制成絮凝劑制品，利用絮凝劑制品去除水中重金屬離子的方法，按照以下步驟進行: (1)絮凝劑制品的制備:將菌株發(fā)酵液稀釋后3~10倍離心分離，經(jīng)蒸發(fā)濃縮、加入75~95%的乙醇，乙醇的體積與發(fā)酵液的體積比為1: (2~5)，獲得絮凝沉淀物，取沉淀物經(jīng)離心分離和真空干燥制備成絮凝劑制品； (2)取適當絮凝劑制品加入到濃度為I~120mg/L的重金屬溶液中，使絮凝劑制品的質(zhì)量與重金屬溶液的體積比為(I~10) %克/升，調(diào)節(jié)pH為3~7，在溫度為20~30°C搖床以轉(zhuǎn)速為140~180r/min條件下反應10~90min，使水中重金屬被充分吸收；后5000~10000r/min離心分離5~IOmin后取上清液,等離子體發(fā)射光譜儀法測定溶液中的重金屬尚子濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法，其特征在于所述斜面培養(yǎng)基成分為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，瓊脂20g/L，pH =7,分裝入試管，121°C下高壓滅菌30min，制成斜面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基成分為:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，pH7，12rC下高壓滅菌30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法，其特征在于所述優(yōu)化培養(yǎng)基成分為:可溶性淀粉15g/L，酵母膏3g/L，K2HP046g/L，MgSO4.7Η200.2g/L, NaCl0.lg/L, pH8，在 121°C下高壓滅菌 30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用產(chǎn)絮菌發(fā)酵液去除水中重金屬離子的方法，其特征在于所述重金屬溶液為含鉛離子、銅離子、鋅離子和鎳離子的重金屬離子的溶液，或者含重金屬鉛離子的蓄電池生產(chǎn)廢水。
【文檔編號】C02F101/20GK103833144SQ201410006084
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】姜彬慧, 胡筱敏, 李亮, 付麗麗, 李鳳達, 楊程程, 趙研, 鄧述波 申請人:東北大學