專利名稱：用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒、基因工程菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒和一種高效降解硝基苯的基因工程菌，以及上述重組質(zhì)粒和基因工程菌的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，水污染問題日益加重，自然水體中的污染物，尤其是硝基苯類等芳香族難降解化合物的污染，已嚴(yán)重威脅到人類及其他生物的安全。采用傳統(tǒng)的物理化學(xué)工藝不僅成本高，而且容易引起二次污染，在處理后的水體中殘留了化學(xué)藥劑并產(chǎn)生新的污染物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒、 基因工程菌及其制法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒， 在酶切位點(diǎn)EcoRI和XhoI之間依次含有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的基因序列。一種含有上述重組質(zhì)粒的基因工程菌，該基因工程菌保存在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為CGMCC No. 4798。一種上述用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒的制備方法，包括以下步驟
(1)通過PCR獲得編碼硝基苯降解過程中所需酶(硝基苯硝基還原酶、羥基苯胺變位酶和2-氨基酚-1，6-雙加氧酶)的編碼基因；
(2)將上述基因連接到載體pET-21a(+)中，再通過PCR獲得三個(gè)帶T7啟動子的編碼基因，如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 所示；
(3)通過重疊PCR將SEQID NO. 1和SEQ ID N0. 2連接，再連接到另一新載體 pET-21a(+)，得到重組載體；
(4)通過酶切法將SEQID N0. 3連接到步驟(3)獲得的重組載體中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒。—種上述基因工程菌的制備方法，具體為將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 BL21(DE3)中，即得到基因工程菌。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明硝基苯降解工程菌株P(guān)ET-NB能有效地降解溶液中的硝基苯，形成開環(huán)產(chǎn)物，提高水體可生化性。本發(fā)明的用于降解硝基苯的基因工程菌已在中國專利局指定的保藏單位“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”保藏，保藏日期為2011年4月觀日，保藏編號為CGMCC No. 4798。


圖1是重組質(zhì)粒圖譜；
圖 2 是核酸電泳圖，其中，M =DNA marker ；1 :SEQ ID No. 3 ；2 :SEQ ID No. 1 ；3 :SEQ IDNo. 2 ；
圖3是基因工程菌PET-NB對硝基苯的降解曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一方面提供了一種重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒攜帶硝基苯硝基還原酶、羥基苯胺變位酶和2-氨基酚-1，6-雙加氧酶的編碼序列，硝基苯硝基還原酶、羥基苯胺變位酶和 2-氨基酚-1，6-雙加氧酶的編碼序列分別如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所
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本發(fā)明另一方面還提供了一種高效降解硝基苯的基因工程菌，該基因工程菌含有上述重組質(zhì)粒(如圖1所示)。上述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟
1、通過PCR獲得編碼硝基苯降解過程中所需酶(硝基苯硝基還原酶、羥基苯胺變位酶和2-氨基酚-1，6-雙加氧酶)的編碼基因；
2、將上述基因連接到載體pET-21a(+)中，再通過PCR獲得三個(gè)帶T7啟動子的編碼基因，如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 所示；
3、通過重疊PCR將SEQID NO. 1和SEQ ID N0. 2連接，再連接到另一新載體 pET-21a(+)，得到重組載體；
4、通過酶切法將SEQID N0. 3連接到步驟(3)獲得的重組載體中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒。另一方面，本發(fā)明提供了一種所述高效降解硝基苯的基因工程菌的構(gòu)建方法，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，即得到所述基因工程菌，該基因工程菌已于2011年4月觀日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，命名為 PET-NB。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)例僅限于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例例中未注明的具體實(shí)驗(yàn)條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。一、培養(yǎng)基的配制
LB培養(yǎng)基成分為每升中含有5g酵母粉，IOg蛋白胨和lOgNaCl。固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基中加入洲瓊脂粉。必要時(shí)，在培養(yǎng)基中加入50 μ g/ml的氨芐青霉素(Amp)以增加培養(yǎng)基的選擇性。二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)GenBank中公布的已知硝基苯硝基還原酶、羥基苯胺變位酶和2-氨基酚-1，6-雙加氧酶的編碼基因，分別設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)(EC0RI、HindIII、)(h0I)的引物，引物序列分別如SEQ ID N0. 4、所示，經(jīng)PCR得到上述酶的編碼基因。將所得DNA片段和載體pET_21a (+ )在37°C下經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，用DNA純化試劑盒純化后，分別于16°C在連接酶作用下進(jìn)行，得到含有相應(yīng)基因的載體。然后再以構(gòu)建的載體為模板，設(shè)計(jì)帶有重疊區(qū)的引物，經(jīng)過PCR得到帶有T7啟動子的編碼基因，即SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2。圖2為 SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 的電泳圖；其中 SEQ ID NO. 1 的下游和 SEQ ID N0. 2的上游引物含有一段互補(bǔ)區(qū)，SEQ ID NO. 1的上游和SEQ ID N0. 2的下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)BglII和HindIII,引物序列分別如SEQ ID NO. 10 12及SEQ ID N0. 7所示，經(jīng)過重疊 PCR 將 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 連接成一 DNA 片段，在 37°C 下經(jīng) BglII 和 HindIII 兩限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，于16°C在連接酶作用下連接至載體pET-21a ( + )。用帶有酶切位點(diǎn)HindIII和XhoI的引物經(jīng)PCR得到DNA片段SEQ ID NO. 3，引物序列分別如SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 9所示，再以上述雙酶切和連接的條件將該片段連接至含有PCR將SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的pET_21a ( + )中，得到所需的重組質(zhì)粒。三、基因工程菌的構(gòu)建
將2 μ 1上述重組質(zhì)粒與100 μ 1BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合，在冰上靜置30min，42°C水浴90 再冰浴3 51^11，然后加入90(^1 LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm培養(yǎng)濁后涂布于含有Amp 的LB平板上，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，挑出的單菌落即是所構(gòu)建的基因工程菌。四、基因工程菌對硝基苯降解能力的研究
將基因工程菌接種至含400mg/L硝基苯的LB培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm條件下培養(yǎng)， 每天取樣并檢測剩余硝基苯含量，經(jīng)過一星期后，硝基苯含量僅剩原來的20%(如圖3所示)， 結(jié)果表明工程菌能高效降解硝基苯。
權(quán)利要求
1.一種用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒，其特征在于，在酶切位點(diǎn)BglII和XhoI之間依次含有 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 的基因序列。
2.一種含有權(quán)利要求1所述重組質(zhì)粒的基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌保存在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為CGMCC No. 4798。
3.—種權(quán)利要求1所述用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)通過PCR獲得編碼硝基苯降解過程中所需的硝基苯硝基還原酶、羥基苯胺變位酶和2-氨基酚-1，6-雙加氧酶的編碼基因；(2)將上述基因連接到載體pET-21a(+)中，再通過PCR獲得三個(gè)帶T7啟動子的編碼基因，如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3 所示；(3)通過重疊PCR將SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2連接，再連接到另一新載體 pET-21a(+)，得到重組載體；(4)通過酶切法將SEQID NO. 3連接到步驟(3)獲得的重組載體中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒。
4.一種權(quán)利要求2所述基因工程菌的制備方法，其特征在于，該方法具體為將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)中，即得到基因工程菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于降解硝基苯的重組質(zhì)粒、基因工程菌及其制備方法。重組質(zhì)粒在酶切位點(diǎn)BglII和XhoI之間依次含有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的基因序列；本發(fā)明硝基苯降解工程菌株P(guān)ET-NB能有效地降解溶液中的硝基苯，形成開環(huán)產(chǎn)物，提高水體可生化性。
文檔編號C02F101/38GK102286508SQ20111017072
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者劉丹鳳, 劉雙江, 賈小明, 趙宇華, 金丹鳳 申請人:浙江大學(xué)