本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種近紅外熒光七甲川菁染料及其在制備腫瘤診斷試劑和/或成像試劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

分子影像技術(shù)的快速發(fā)展使得對腫瘤的診斷由傳統(tǒng)的解剖形態(tài)向前推進(jìn)到功能、代謝，甚至是受體和基因的分子水平。其中熒光成像技術(shù)可及時、準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)腫瘤，連續(xù)、無創(chuàng)觀察腫瘤的變化，具有檢測時間快(最快1s)，不需注射底物等優(yōu)點(diǎn)，已成為腫瘤診斷和治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，熒光波長越接近900nm穿透能力越強(qiáng)，因此，吸收及發(fā)射光譜均處于700～1000nm的近紅外熒光(nirf)應(yīng)是觀測生理指標(biāo)的最佳選擇。已證實(shí)，該類型的熒光染料組織滲透性好，自發(fā)熒光低，標(biāo)記腫瘤細(xì)胞后能夠通過成像設(shè)備從深層組織中檢測到腫瘤，臨床應(yīng)用前景巨大。

近紅外熒光(nearinfraredfluorescence,nirf)染料是由兩端或中間的雜環(huán)、芳環(huán)與分子內(nèi)部的多次甲基鏈組成的一個大π共軛體系化合物，波譜范圍在近紅外區(qū)(700～1000nm)。許多近紅外染料如cy5.5和ir800-cw與肽或特異性抗原標(biāo)記后成功用于腫瘤模型的可視化診斷，其中最具代表性的是吲哚菁綠(icg)，結(jié)構(gòu)式如下：

該化合物是唯一被美國fda批準(zhǔn)可用于臨床診斷的近紅外熒光染料。該染料在癌癥診斷研究中可實(shí)現(xiàn)癌癥原位、實(shí)時、靶向的無損監(jiān)測。但icg無腫瘤靶向性，穩(wěn)定性較差，在極性溶劑中會迅速聚集并分解，且在光照環(huán)境下會加速分解，限制了其在熒光成像、目標(biāo)組織定位方面的應(yīng)用。

而且，常規(guī)nirf染料用于腫瘤成像需要結(jié)合靶向性片段，如抗體、多肽和腫瘤表面分子等，形成特異性染料標(biāo)記物。由于靶向片段只能檢測到部分特異性腫瘤細(xì)胞，且化學(xué)結(jié)合可能會改變靶分子的親合力，因此有必要發(fā)展簡單且可直接用于非侵入性腫瘤成像的新型nirf染料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種近紅外熒光七甲川菁染料(dz-1)及其在制備腫瘤診斷試劑和/或成像試劑中的應(yīng)用，使得腫瘤診斷試劑和/或成像試劑具有良好的腫瘤靶向性和良好的穩(wěn)定性。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種近紅外熒光七甲川菁染料，其結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明還公開了上述近紅外熒光七甲川菁染料在制備腫瘤診斷試劑和/或成像試劑中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述的腫瘤為肝癌。

優(yōu)選地，缺氧和oatp3a1分子介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對所述紅外熒光七甲川菁染料的吸收。

進(jìn)一步優(yōu)選地，在缺氧環(huán)境下肝癌細(xì)胞對紅外熒光七甲川菁染料的吸收顯著增加。

進(jìn)一步優(yōu)選地，缺氧條件能夠使oatp3a1分子表達(dá)水平上調(diào)。

優(yōu)選地，所述腫瘤診斷試劑和/或成像試劑是能夠靶向結(jié)合hep3b細(xì)胞的藥物。

優(yōu)選地，所述腫瘤成像試劑為能夠識別皮下移植腫瘤邊界的腫瘤成像試劑。

優(yōu)選地，所述近紅外熒光七甲川菁染料的動物給藥量為0.2～0.8μmol/kg。

優(yōu)選地，所述近紅外熒光七甲川菁染料的細(xì)胞給藥量為10～30μm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明公開的近紅外熒光七甲川菁染料使用的是化合物dz-1，該化合物是將商品化的近紅熒光染料mhi-148一側(cè)的(ch2)5co2^-替換為(ch2)4so3^-，修飾后的化合物水溶性提高，在活體成像中可以靜脈注射的方式給藥，實(shí)現(xiàn)與臨床icg相同處理和相同的給藥方式。

本發(fā)明還公開了上述近紅外熒光七甲川菁染料在制備腫瘤診斷試劑和/或成像試劑中的應(yīng)用，本發(fā)明先后通過培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系、裸鼠肝癌皮下移植模型、裸鼠肝癌原位移植模型以及兔肝癌原位移植模型，明確該染料能夠被肝癌細(xì)胞特異性吸收，聚集于腫瘤部位，配合非侵入性nirf成像，能夠檢測到腫瘤發(fā)生的部位，且腫瘤部位熒光強(qiáng)度、特異性和靶向性均優(yōu)于臨床使用的icg，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞對該染料的特異性吸收與缺氧和活化的oatp3a1信號分子相關(guān)。同時，在人肝癌裸鼠移植模型中，通過術(shù)間nirf探頭，可以清楚識別腫瘤發(fā)生的部位和邊界。從而這使得該染料具有了腫瘤特異性靶分子和成像的雙重功能，在臨床腫瘤位置和邊界的探查方面顯示出良好的潛能。

附圖說明

圖1-1為本發(fā)明使用的近紅外熒光七甲川菁染料(dz-1)的發(fā)射波譜。

圖1-2為本發(fā)明使用的近紅外熒光七甲川菁染料(dz-1)的激發(fā)波譜。

圖2為dz-1和icg在肝癌細(xì)胞中不同時間點(diǎn)的近紅外熒光強(qiáng)度圖。

圖3-1為dz-1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型各臟器中的分布圖。

圖3-2為icg在人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型各臟器中的分布圖。

圖4-1為dz-1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型中的代謝特征圖。

圖4-2為icg在人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型中的代謝特征圖。

圖5-1為dz-1在裸鼠肝原位腫瘤中的成像圖。

圖5-2為icg在裸鼠肝原位腫瘤中的成像圖。

圖6-1為在肝癌腎包膜移植模型中，腫瘤的整體形態(tài)學(xué)結(jié)果和dz-1的活體成像結(jié)果。

圖6-2為在肝癌腎包膜移植模型中，對腎臟部位做切片后，近紅外熒光、h&e染色和免疫組織染色觀察到的腎包膜瘤組織圖。

圖7-1為在兔肝臟原位腫瘤模型中，腫瘤的整體形態(tài)圖、nirf成像圖和切片染色結(jié)果圖。

圖7-2為在兔肝臟原位腫瘤模型中的nirf成像圖。

圖8為術(shù)間nirf探頭對裸鼠皮下移植瘤邊界的識別圖。

圖9-1為細(xì)胞熒光檢測圖，展示缺氧和oatp3a1對dz-1的吸收的影響。

圖9-2為圖9-1的量化結(jié)果圖。

圖9-3為缺氧對腫瘤細(xì)胞中oatp3a1的mrna表達(dá)水平的影響圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

1、dz-1的激發(fā)波譜和發(fā)射波譜

七甲川菁染料dz-1是將商品化的近紅熒光染料mhi-148一側(cè)的(ch2)5co2^-替換為(ch2)4so3^-，修飾后的化合物dz-1水溶性提高，實(shí)現(xiàn)與臨床用近紅外染料icg一樣的靜脈注射途徑。

本發(fā)明的近紅外熒光七甲川菁染料(dz-1)的結(jié)構(gòu)式為：

商品化的近紅熒光染料mhi-148的結(jié)構(gòu)式為：

將dz-1溶于pbs通過f97pro熒光分光光度計(jì)檢測該化合物的激發(fā)波譜和發(fā)生波譜，結(jié)果見圖1-1和1-2，dz1的最佳激發(fā)波長是767nm，最佳發(fā)射波長是798nm，符合近紅外熒光染料的光學(xué)特征。

2、肝癌細(xì)胞系對dz-1的代謝速度

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞系hep3b消化后接種于15mm的培養(yǎng)小皿中，24h后分別加入20μm的icg和dz-1，作用30min后，用pbs洗滌三次，洗去未結(jié)合的染料，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。分別在不同時間點(diǎn)(1h、3h、6h、12h和24h)，通過倒置近紅外熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞中近紅外熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示在圖2中，根據(jù)圖2可知，1h時腫瘤細(xì)胞中熒光強(qiáng)度最高，3h后熒光強(qiáng)度開始減弱，染料代謝加快，12h和24h時dz-1作用的細(xì)胞依舊可以檢測到熒光信號，而icg作用的細(xì)胞從3h開始熒光強(qiáng)度就顯著減弱，明顯比dz-1代謝快，24h后幾乎檢測不到熒光信號。這表明，相較于icg，dz-1具有更好的穩(wěn)定性，其分解速度更慢。

3、dz-1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型中的代謝和分布

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的hep3b細(xì)胞(2×10⁶/只)接種于裸鼠皮下，建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型。2周后，將icg(10μmol/kg)和dz-1(0.5μmol/kg)分別尾靜脈注射兩組荷瘤鼠。在注射后不同的時間點(diǎn)(16h、24h、48h)麻醉處死模型鼠，解剖后，分別取出心、肝、脾、肺、腎和腫瘤，使用相同的方法在小動物活體成像儀下檢測各組織器官的熒光信號，比較各個組織器官單位面積的熒光強(qiáng)度(roi)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示在圖3-1和圖3-2中，由圖3-1可知，dz-1在腫瘤組織中具有較好的特異性，在16h、24h、48h熒光強(qiáng)度顯著高于其它臟器；由圖3-2可知，icg不僅在腫瘤部位，同時也在肝臟和肺臟部位有大量聚集，在不同時間點(diǎn)，與其它臟器相比腫瘤組織中熒光強(qiáng)度的特異性較差。

4、icg和dz-1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的代謝特征

相同方法制備人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，將icg(10μmol/kg)和dz-1(0.5μmol/kg)分別尾靜脈注射皮下荷瘤鼠，在不同時間點(diǎn)活體成像測定腫瘤部位nirf強(qiáng)度(tumorroi，t)，并同時測定相同面積癌旁組織的nirf強(qiáng)度(roi，b)，計(jì)算t/b值。結(jié)果如圖4-1和圖4-2所示，由圖4-1可知，dz-1注射荷瘤裸鼠后，腫瘤部位熒光強(qiáng)度逐漸增加，48h后開始緩慢降低，96h后急劇下降；背景熒光強(qiáng)度在0～8h之間遞增，8h后逐步降低，84h后趨于穩(wěn)定并達(dá)到最低，此時染料基本代謝完畢，背景完全為代謝背景，t/b值在96h前一直增強(qiáng)并在96h達(dá)到峰值，隨后驟降，與腫瘤部位熒光強(qiáng)度變化相一致。由圖4-2可知，icg注射荷瘤裸鼠后，腫瘤部位熒光強(qiáng)度在2h即達(dá)到峰值，然后呈遞減趨勢；背景值在2～36h之間呈現(xiàn)快速遞減，36h后趨于穩(wěn)定并達(dá)到最小值，此時染料完全代謝，背景完全為代謝背景；t/b值一直遞增并在36h達(dá)到峰值，隨后逐步降低。icg背景與腫瘤熒光強(qiáng)度差主要是由于背景值在前20h代謝非常快，但腫瘤部位icg代謝較背景慢，形成熒光差。

5.dz-1在裸鼠肝臟原位腫瘤模型中的特異性成像

用帶有光素酶基因的慢病毒轉(zhuǎn)染hep3b細(xì)胞，使用puromycin(終濃度為0.1μg/ml)進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選和擴(kuò)增培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)luciferase，將培養(yǎng)的hep3b-luc細(xì)胞(2×10⁶/只)接種于裸鼠肝臟部位，建立裸鼠肝臟原位腫瘤模型。相同方法檢測模型鼠肝臟部位的luciferase信號。同時荷瘤鼠分別尾靜脈注射icg(10μmol/kg)和dz-1(0.5μmol/kg)，24h后使用小動物活體成像儀進(jìn)行檢測。將荷瘤鼠處死后解剖心、肝、脾、肺、腎等器官進(jìn)行熒光信號的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示在圖5-1和圖5-2中，其中，bil為腫瘤部位生物發(fā)光，nirf為熒光信號。由圖5-2可知，icg在肝臟中主要聚集于肝門部位，肝邊緣的腫瘤則不容易檢測到，而當(dāng)肝臟大部分肝臟癌變后則能基本識別。不僅如此，icg在活體成像中能夠識別肝臟原位腫瘤，但離體后腫瘤部位生物發(fā)光與熒光部位存在差異。與之不同，如圖5-1所示，dz-1則可以很好地識別肝臟上較小的腫瘤區(qū)域，無論是在活體中還是離體中，腫瘤部位生物發(fā)光與熒光部位吻合度良好。

6.dz-1在肝癌裸鼠腎包膜移植模型中對腫瘤的特異性識別

將7周齡的雄性裸鼠麻醉后，背部切口暴露腎臟，在解剖顯微鏡下將臨床肝癌手術(shù)切除標(biāo)本(c90706)移植入腎包膜下，將腎臟送回腹腔并縫合傷口。2月后移植部位局部隆起，裸鼠靜脈注射dz-1(0.5μmol/kg)24h后，用近紅外熒光活體成像系統(tǒng)檢測腫瘤，結(jié)果如圖6-1所示，活體成像結(jié)果與解剖小鼠取出小鼠腎臟后觀察到的瘤組織具有較高的吻合度。處死裸鼠后取完整的腎臟部分做冰凍切片，部分做石蠟切片。取切片進(jìn)行h&e染色確定腎包膜瘤組織，如圖6-2所示，在近紅外熒光顯微鏡下能夠看到熒光分布的范圍基本與h&e染色部位一致；進(jìn)一步采用免疫熒光檢測了腫瘤部位cea和afp的表達(dá)(其中cea和afp均為肝癌特異性標(biāo)志物，在腫瘤部位均為表達(dá)陽性)，結(jié)果如圖6-2所示，陽性表達(dá)區(qū)域與熒光部位一致(t和k分別指示的為肝癌組織和正常小鼠腎臟)，確認(rèn)dz-1可以識別腫瘤和正常細(xì)胞的界限。

7.dz-1在兔肝臟原位腫瘤模型中的成像

將新鮮的兔肝癌vx2腫瘤組織皮下移植日本大耳白兔，2周后形成實(shí)體瘤。無菌取出皮下瘤組織，切成3×3mm³，戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉兔，手術(shù)切開兔腹腔暴露肝臟，在肝葉切開1cm口，放入2～3塊vx2瘤組織，并用生物膠封合，觀察兔的活動狀況。10天后，實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈注射近紅外熒光染料dz-1(0.5μmol/kg)，12h后相同方法麻醉手術(shù)兔，切開腹腔暴露肝臟，使用近紅外熒光光纖手術(shù)探查儀對肝臟部位的腫瘤邊界進(jìn)行探查，確定范圍后手術(shù)切除肝臟，用pbs洗滌三次后，放置平皿中，使用相同的方法在小動物活體成像儀下觀察nirf信號，并將信號部位使用4％的福爾馬林固定后制備病理切片。給vx2肝癌原位移植模型的兔注射dz-1后進(jìn)行手術(shù)探查，在近紅外手術(shù)探測儀下可見到在兔肝葉部位形成明顯的nirf信號，與肉眼觀察的腫瘤范圍基本一致(如圖7-1所示)，進(jìn)一步采用活體成像儀進(jìn)行觀察，均可發(fā)現(xiàn)腫瘤部位的nirf信號(如圖7-2所示)。將熒光部位組織切片后h&e染色可見明顯的肝癌組織結(jié)構(gòu)(如圖7-1所示)，病理結(jié)果與手術(shù)探查和活體成像的結(jié)果一致。

8.術(shù)間nirf探頭對裸鼠皮下移植瘤邊界的識別

將1×10⁶的人肝癌細(xì)胞(200μl)注射于裸鼠皮下，2星期后形成肉眼可見的腫瘤，裸鼠尾靜脈注射dz-1(0.5μmol/kg)，利用術(shù)間nirf探頭對腫瘤發(fā)生的部位和邊界進(jìn)行探查，結(jié)果如圖8所示，可清楚探查到皮下移植腫瘤的邊界。

9.dz-1對肝癌細(xì)胞的特異性識別與缺氧和活化的oatp3a1分子相關(guān)

為了檢測缺氧和oatp抑制劑對dz-1吸收的影響，培養(yǎng)24h的肝癌細(xì)胞hep3b加入dz-1(終濃度為20μm)，在1％o2下作用24h，或者加入oatp抑制劑bsp(250μm)作用1h。結(jié)果展示在圖9-1和圖9-2中，圖9-1顯示，肝癌細(xì)胞缺氧處理后對nirf染料的吸收增加，用oatp抑制劑bsp處理后對nirf染料的吸收減弱；oatp3a1特異性shrnas(shoatp3a1)作用于肝癌細(xì)胞，nirf染料的吸收減弱(p<0.05)，表明，缺氧環(huán)境下hep3b腫瘤細(xì)胞對dz-1的吸收顯著增加(p<0.05)，而bsp明顯抑制了腫瘤細(xì)胞對染料的吸收。為了進(jìn)一步量化，在圖9-2中，將正常對照組的nirf熒光強(qiáng)度設(shè)定為100％，其它各個處理組相對正常對照組的熒光強(qiáng)度百分?jǐn)?shù)進(jìn)行了比較。進(jìn)一步，三種肝癌細(xì)胞7721，hep3b和c90706經(jīng)過1％o2的缺氧處理24h后，通過rt-pcr檢測了三個肝癌細(xì)胞中，oatp3a1mrna表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)oatp3a1的表達(dá)均上調(diào)，且缺氧能夠進(jìn)一步增加它的表達(dá)。當(dāng)我們使用oatp3a1靶向性sirna(shoatp3a1)進(jìn)行干擾后，發(fā)現(xiàn)hep3b腫瘤細(xì)胞對dz-1的吸收減少了50％，說明缺氧和oatp3a1介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對dz-1染料的吸收。

綜上，本發(fā)明培養(yǎng)的人的肝癌細(xì)胞系hep3b中加入近紅外熒光染料dz-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)nirf染料可被腫瘤組織自發(fā)吸收，熒光可持續(xù)24h。利用hep3b細(xì)胞分別建立裸鼠皮下、肝臟原位和腎包膜移植模型，通過nirf活體成像均可檢測到腫瘤發(fā)生的部位，且腫瘤部位單位面積熒光強(qiáng)度均優(yōu)于臨床使用的icg。特別是在腫瘤的腎包膜移植模型中，nirf可以清晰識別腫瘤邊界，與h&e染色和免疫熒光的檢測結(jié)果一致。進(jìn)一步使用兔的肝癌模型，評估該染料用于腫瘤術(shù)中導(dǎo)航的可行性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該染料可以特異性識別腫瘤部位，熒光強(qiáng)度和特異性優(yōu)于icg，顯示出該染料用于臨床腫瘤檢測和診斷良好潛能。

在機(jī)制研究方面，缺氧和oatp在介導(dǎo)nirf染料吸收中起重要作用。已證實(shí)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organicaniontransporterpeptides，oatps)的功能涉及兩性分子化合物的吸收，包括一些藥物和外源性物質(zhì)，我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞對nirf染料的特異性吸收能夠被oatp競爭性抑制物溴磺酚酞(bromosulfophthalein，bsp)明顯減弱，且缺氧可以進(jìn)一步促進(jìn)肝癌細(xì)胞對nirf染料的吸收。因?yàn)槿毖跏歉伟┘?xì)胞中普遍存在的現(xiàn)象，與腫瘤代謝、侵襲、新血管行程、轉(zhuǎn)移、耐藥和差的臨床預(yù)后密切相關(guān)。我們在實(shí)驗(yàn)中用oatp3a1特異性的短發(fā)夾rna(shrnas)作用于腫瘤細(xì)胞可以顯著降低oatp3a1基因的轉(zhuǎn)錄水平，減少腫瘤細(xì)胞對nirf染料的吸收。缺氧能夠進(jìn)一步增加oatp3a1的mrna的表達(dá)，肝癌細(xì)胞與nirf染料的特異性結(jié)合依賴缺氧和活化oatp3a1信號分子。

依據(jù)nirf染料與肝癌腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合，可以將nirf染料應(yīng)用于肝癌的早期預(yù)警和快速診斷。