本發(fā)明屬于顆粒制備與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種適用于流式細胞儀的熒光微球標準物質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
：流式細胞術(shù)(Flowcytometry，簡稱FCM)是一種以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)，可對單個細胞準確地定量分析和分類。流式細胞術(shù)在臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，為了確保檢測結(jié)果的準確性，流式細胞儀在使用前需要使用質(zhì)控微球?qū)x器的熒光分辨率、靈敏度、光路及液流準直行、光電倍增管穩(wěn)定性等進行校正，該質(zhì)控微球即為熒光微球標準物質(zhì)。目前我國流式細胞儀上使用的熒光微球全部依賴于進口，價格極其昂貴。國外的熒光微球標準物質(zhì)通常是采用異硫氰酸熒光素(FITC)對微球進行標記。由于FITC對光、溫度和pH都很敏感，容易發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，穩(wěn)定性差，使得FITC標記微球的制備工藝復(fù)雜，難以保證粒徑的單分散性和熒光強度的均一性，并且在使用、存儲和運輸上要求苛刻。因此，尋找可替代的熒光染料并開發(fā)出一種適用于流式細胞儀且性能穩(wěn)定的熒光微球具有重要的實用價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明提供一種流式熒光微球標準物質(zhì)及其制備方法。該方法制備的熒光微球標準物質(zhì)粒徑嚴格單分散，熒光強度均一，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種流式熒光微球標準物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：(1)通過分散聚合法制得種子微球；(2)將所述種子微球分散到十二烷基磺酸鈉(SDS)水溶液中，將疏水性熒光染料溶于溶脹劑中，加入到種子微球的分散體系，經(jīng)乳化、震揺、旋蒸，得到流式熒光微球標準物質(zhì)。所述分散聚合法的步驟包括將乙醇、水、分散劑、引發(fā)劑、交聯(lián)劑和單體混合均勻，然后在惰性氣體保護下進行聚合反應(yīng)，制得所述種子微球。所述乙醇、去離子水、分散劑、引發(fā)劑、交聯(lián)劑和單體的用量比為：(90～150)mL：(5～12)mL：(1.8～2.2)g：(0.4～0.8)g：(0.05～0.12)g：(40～60)g。所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，交聯(lián)劑為二乙烯基苯，單體為苯乙烯。在步驟(2)中，所述乳化采用高剪切分散乳化機，轉(zhuǎn)速為2000～5000r/min，時間為1～10min；震搖采用恒溫搖床，轉(zhuǎn)速為100～300r/min，4～8h；旋蒸采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在20～30℃下進行旋轉(zhuǎn)蒸餾，時間為2～8h，壓強為0.03～0.07MPa。所述乳化和震搖在常溫下進行。在步驟(2)中，所述種子微球、十二烷基磺酸鈉水溶液、疏水性熒光染料和溶脹劑的用量比為：(0.1～1.0)g：(10～100)mL：(1～1000)×10-5g：(1～10)mL，其中，在所述十二烷基磺酸鈉水溶液中，十二烷基磺酸鈉的濃度為0.1～1.0wt％。在步驟(2)中，所述疏水性熒光染料為苝系衍生物、香豆素類染料、油溶性量子點中的一種。所述苝系衍生物為苝四羧酸乙酯、苝四羧酸二酐、苝二甲酸二異丁酯、苝二酰亞胺中的一種。所述香豆素類染料為香豆素6、香豆素3-羧酸乙酯、4-羥基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素中的一種。所述油溶性量子點為ZnSe、CdSe、ZnS、ZnCdS中的一種。在步驟(2)中，所述溶脹劑為沸點低于60℃的溶脹劑，優(yōu)選為二氯甲烷。本發(fā)明的目的還在于，提供一種上述方法制備的流式熒光微球標準物質(zhì)。所述流式熒光微球標準物質(zhì)為內(nèi)部包覆有熒光分子的聚苯乙烯微球，粒徑為3.0～3.5μm，變異系數(shù)為1％～4％，488nm光激發(fā)時的最大發(fā)射波長為520～540nm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：(1)本發(fā)明采用兩步法，先通過分散聚合法制備得到3.0～3.5μm、粒徑嚴格單分散的種子微球，將疏水性熒光染料溶于溶脹劑中，再加入到種子微球的分散體系，然后通過乳化、震揺和旋蒸等聯(lián)合處理步驟，將疏水性熒光染料溶脹進入種子微球內(nèi)部，制得粒徑嚴格單分散、熒光強度均一、具有優(yōu)異穩(wěn)定性的熒光微球標準物質(zhì)。(2)本發(fā)明中溶脹過程采用種子微球的水相懸浮體系，同時將疏水性熒光染料溶于溶脹劑中，由于種子微球具有親油疏水性，這便提供了熒光染料進入種子微球的驅(qū)動力。但由于溶脹劑為油相，與水相不相容，致使疏水性熒光染料無法進入種子微球。因此，本發(fā)明采用聯(lián)合處理方法-乳化和震揺，不但可以使種子微球盡可能分散均勻，而且還可以提供強大的剪切力，將油相(溶有熒光染料的溶脹劑)打碎為極小的小油滴，增大其比表面積，使油、水兩相充分接觸，熒光染料均勻地進入種子微球，從而保證了制備的熒光微球熒光強度均一。(3)由于溶脹時種子微球會有不同程度的脹大，溶脹劑攜帶熒光分子向種子微球內(nèi)部滲透，最終達到一種溶脹平衡狀態(tài)(微球不再繼續(xù)變大)，此時的微球與原來種子微球相比，變得軟而大。本發(fā)明先通過乳化和震揺實現(xiàn)溶脹后的種子微球粒徑均勻分布，而旋蒸可以將種子微球內(nèi)部的溶脹劑全部蒸發(fā)走，熒光染料則被緊緊地包覆在種子微球內(nèi)部，包覆了熒光染料的種子微球又重新恢復(fù)到原來種子微球大小(會略大一點，但差別極小)，從而重新呈現(xiàn)為粒徑上的嚴格單分散。(4)本發(fā)明的溶脹劑采用沸點低于60℃的溶脹劑，尤其是二氯甲烷，旋蒸時很容易被完全蒸發(fā)走，避免旋蒸過程引起團聚；并且容易回收，可循環(huán)利用，減少污染。(5)本發(fā)明的熒光微球標準物質(zhì)在488nm光激發(fā)時的最大發(fā)射波長為520～540nm，可適用于流式細胞儀的校準。(6)本發(fā)明的流式熒光微球標準物質(zhì)具有優(yōu)異的光、熱、化學(xué)穩(wěn)定性，其原因主要有以下3點：一、采用的熒光染料本身性質(zhì)較為穩(wěn)定；二、采用了疏水性熒光染料，制備的熒光微球標準物質(zhì)分散于水相中，染料不易泄露；三、將熒光染料包覆在微球內(nèi)部，而不是吸附或連接在微球表面上，近一步提高其穩(wěn)定性。附圖說明圖1為實施例1流式熒光微球標準物質(zhì)粒徑的體積分布圖。圖2為實施例2流式熒光微球標準物質(zhì)的熒光發(fā)射譜圖，激發(fā)波長為488nm。圖3為實施例3流式熒光微球標準物質(zhì)的透射電子顯微鏡照片。圖4為實施例4流式熒光微球標準物質(zhì)的熒光發(fā)射譜圖，激發(fā)波長為488nm。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。任何熟悉該領(lǐng)域的工程技術(shù)人員根據(jù)上述
發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明所做的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例1一種流式熒光微球標準物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：(1)在三口燒瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮2.2g和乙醇140mL、去離子水9mL，一次性加入溶有偶氮二異丁腈0.76g和二乙烯基苯0.07g的苯乙烯55g，攪拌溶解均勻；通氮氣保護，升溫至69℃，反應(yīng)22h；經(jīng)離心洗滌和干燥，得到種子微球，其粒徑為3.18μm，變異系數(shù)為2.14％。(2)稱取種子微球0.4g加入到100mLSDS水溶液(質(zhì)量分數(shù)為0.25％)中，超聲分散，使種子微球分散均勻；將1.0mg苝四羧酸乙酯溶于5mL二氯甲烷中，加入到種子微球的分散體系；經(jīng)乳化、震搖、旋蒸，離心洗滌，得到流式熒光微球標準物質(zhì)。其中，乳化采用高剪切分散乳化機，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為3000r/min，時間為5min；震搖采用恒溫搖床，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為120r/min，時間為6h；旋蒸采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在25℃下旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾4h，壓強為0.05MPa。上述流式熒光微球標準物質(zhì)的粒徑為3.22μm，變異系數(shù)為2.36％，單分散性良好。由圖1粒徑的體積分布圖可知，其粒徑呈正態(tài)分布，且分布很窄，表明熒光微球具有良好的單分散性。實施例2一種流式熒光微球標準物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：(1)在三口燒瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮2.0g和乙醇120mL、去離子水7mL，一次性加入溶有偶氮二異丁腈0.53g和二乙烯基苯0.1g的苯乙烯50g，攪拌溶解均勻；通氮氣保護，升溫至70℃，反應(yīng)20h；經(jīng)離心洗滌和干燥，得到種子微球，其粒徑為3.02μm，變異系數(shù)為1.78/％。(2)稱取種子微球0.5g加入到50mLSDS水溶液(質(zhì)量分數(shù)為0.25％)中，超聲分散，使種子微球分散均勻；將0.2mg苝二甲酸二異丁酯溶于5mL二氯甲烷中，加入到種子微球的分散體系；經(jīng)乳化、震搖、旋蒸，離心洗滌，得到流式熒光微球標準物質(zhì)。其中，乳化采用高剪切分散乳化機，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為5000r/min，時間為2min；震搖采用恒溫搖床，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為280r/min，時間為4h；旋蒸采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在20℃下旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾8h，壓強為0.03MPa。上述流式熒光微球標準物質(zhì)的粒徑為3.04μm，變異系數(shù)為1.92％，單分散性很好。由圖2熒光發(fā)射譜圖可知，其488nm光激發(fā)時的最大發(fā)射波長為532nm。實施例3一種流式熒光微球標準物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：(1)在三口燒瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮1.8g和乙醇98mL、去離子水5mL，一次性加入溶有偶氮二異丁腈0.41g和二乙烯基苯0.05g的苯乙烯44g，攪拌溶解均勻；通氮氣保護，升溫至67℃，反應(yīng)24h；經(jīng)離心洗滌和干燥，得到種子微球，其粒徑為3.36μm，變異系數(shù)為3.32％。(2)稱取種子微球1.0g加入到100mLSDS水溶液(質(zhì)量分數(shù)為0.25％)中，超聲分散，使種子微球分散均勻；將5mg香豆素6溶于10mL二氯甲烷中，加入到種子微球的分散體系；經(jīng)乳化、震搖、旋蒸，離心洗滌，得到流式熒光微球標準物質(zhì)。其中，乳化采用高剪切分散乳化機，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為4000r/min，時間為7min；震搖采用恒溫搖床，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為200r/min，時間為5h；旋蒸采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在30℃下旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾8h，壓強為007MPa。上述流式熒光微球標準物質(zhì)的粒徑為3.42μm，變異系數(shù)為3.38％，單分散性良好。圖3透射電子顯微鏡照片表明，熒光微球的表面光滑，無破損，球形度高；微球之間沒有粘連和團聚現(xiàn)象；微球排列整齊。實施例4一種流式熒光微球標準物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：(1)在三口燒瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮1.9g和乙醇130mL、水8mL，一次性加入溶有偶氮二異丁腈0.64g和二乙烯基苯0.06g的苯乙烯57g，攪拌溶解均勻；通氮氣保護，升溫至69℃，反應(yīng)24h；經(jīng)離心洗滌和干燥，得到種子微球，其粒徑為3.17μm，變異系數(shù)為2.93％。(2)稱取種子微球0.1g加入到15mLSDS水溶液(質(zhì)量分數(shù)為0.25％)中，超聲分散，使種子微球分散均勻；將10μgCdSe量子點溶于1mL二氯甲烷中，加入到種子微球的分散體系；經(jīng)乳化、震搖、旋蒸，離心洗滌，得到流式熒光微球標準物質(zhì)。其中，乳化采用高剪切分散乳化機，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為3000r/min，時間為8min；震搖采用恒溫搖床，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為250r/min，時間為3h；旋蒸采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在25℃下旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾8h，壓強為0.05MPa。上述流式熒光微球標準物質(zhì)的粒徑為3.17μm，變異系數(shù)為2.94％，單分散性良好。由圖4熒光發(fā)射譜圖可知，其488nm光激發(fā)時的最大發(fā)射波長為525nm。對比例1流式熒光微球標準物質(zhì)的制備方法基本與實施例1相同，不同點在于：不經(jīng)過乳化、震搖、旋蒸的步驟，制備過程完成后，無法得到微球，得到的產(chǎn)品為完全粘連到一起、軟而粘的不規(guī)則塊狀物，呈乳白色。無法得到微球的原因是：種子微球在SDS水溶液中不能均勻分散，與溶脹劑接觸也不均勻，導(dǎo)致種子微球的溶脹程度不均勻，即有的粒徑增加大，有的增加小，還有些與溶脹劑不接觸的甚至不會發(fā)生溶脹，并且溶脹后的種子微球變軟后完全粘連在一起，無法再分開。對比例2流式熒光微球標準物質(zhì)的制備方法基本與實施例1相同，不同點在于：采用烘箱干燥代替旋蒸，在45℃下干燥4h，得到流式熒光微球標準物質(zhì)。出現(xiàn)下列問題：(1)平均粒徑增大；(2)單分散性變差；(3)熒光強度不均一；(4)溶脹劑不能回收。上述流式熒光微球標準物質(zhì)的平均粒徑為3.83μm，變異系數(shù)為12.54％，單分散性差。測試例室溫、避光條件下，保存1、6、12個月后，使用熒光分光光度計測試并比較488nm光激發(fā)時，發(fā)射波長530nm的熒光響應(yīng)值，每次測試均為隨機取樣。測試結(jié)果見表1，其中，第1、2、3、4組分別為實施例1～4的熒光微球標準物質(zhì)，第5組為市售國外FITC標記熒光微球標準物質(zhì)，第6、7組分別為對比例1和2的熒光微球標準物質(zhì)，由于第6組產(chǎn)品為完全粘連，已經(jīng)不能進行正常的測試。其測試所得的熒光響應(yīng)值見表1。表1熒光強度的均一性和穩(wěn)定性測試1組2組3組4組5組6組7組0月885.16292.562411.5693.661040.76-817.431月884.22292.142390.1793.631006.53-732.646月870.47288.632353.6692.54947.24-793.2912月851.26284.152298.4191.59859.15-424.81由表1數(shù)據(jù)表明：第1～4組熒光強度均一，且穩(wěn)定性優(yōu)異；第5組熒光強度均一，但穩(wěn)定性較差；第7組熒光強度不均一，穩(wěn)定性差。在保存12個月后，第1～5組的熒光衰減率分別為3.83％、2.87％、4.69％、2.21％、17.45％，與國外產(chǎn)品相比，本發(fā)明熒光微球標準物質(zhì)具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。其中，對比例2(第7組)的產(chǎn)品保存6個月比1個月的熒光強度要高、以及12個月后又大幅衰減(與實施例1相比)，這主要是由于制備的熒光微球標準物質(zhì)的熒光強度不均一所致。當(dāng)前第1頁1 2 3