本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域，尤其涉及一種從槍烏賊中提取保健功能性黑色素的新方法。

背景技術(shù)：

槍烏賊是軟體動物門（Mollusca）頭足綱 (Cephalopoda)槍形目（Teuthoidea）槍烏賊科（Loliginidae）的統(tǒng)稱。又稱魷魚、筆管，古稱鎖管、柔魚。槍烏賊科中共包括約50種，其中已成為捕撈對象的約16種，如中國槍烏賊(Loligo chinensis)、日本槍烏賊(L.japonica)、劍尖槍烏賊(L.edulis)、福氏槍烏賊(L.forbesi)、皮氏槍烏賊(L.pealei) 、萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)等。在中國，魷魚的年捕撈量約在230萬噸左右，捕撈量十分巨大。

墨囊是頭足綱所特有的結(jié)構(gòu)，約占其體重的1.3%，用來貯藏防御用的墨汁，此墨汁十分粘稠，富含黑色素、蛋白質(zhì)及多糖。生產(chǎn)加工過程中，墨囊作為廢棄物被丟棄，初步估計一年將產(chǎn)生3萬噸的廢棄墨囊。

黑色素是一類由酚類和/或吲哚類物質(zhì)經(jīng)多步氧化聚合形成的生物色素，槍烏賊的黑色素常與糖蛋白牢固結(jié)合在一起，即形成黑色素-糖蛋白。天然黑色素廣泛存在于動植物體內(nèi)，具有保護、防御功能，并參與許多生理活動，黑色素是目前所知唯一能保護生物體免受輻射傷害的天然內(nèi)源性生物聚合體。國內(nèi)魷魚墨進行了諸多研究，如雷敏等研究了魷魚墨黑色素的免疫調(diào)節(jié)作用，并證明其對機體特異性及非特異性免疫機能具有顯著調(diào)節(jié)作用。劉治東等進行了魷魚墨黏多糖對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究，發(fā)現(xiàn)魷魚墨黏多糖能提高免疫低下小鼠的體液免疫、細胞免疫和非特異性免疫功能。陳士國等通過超速離心法從魷魚墨中提取了黑色素，并采用堿降法制備可溶性黑色素，分別過10kDa和50kDa的超濾膜將所得的黑色素進行分級，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子量在50kDa以上的可溶性黑色素具有很強的自由基清除效果。

現(xiàn)階段黑色素的分離純化方法主要有三種：水洗法、化學(xué)法（酸解法、堿解法）、酶解法。水解法適用于含雜質(zhì)少的樣品，而槍烏賊墨汁成分復(fù)雜，單用此法將造成極大的原料及用水浪費?；瘜W(xué)法反應(yīng)條件劇烈，需用到強酸和強堿，會破壞頭足類墨汁中的黑色素-糖蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)，從而破壞其多種生物活性。酶解法雖反應(yīng)條件溫和，但蛋白酶會破壞與黑色素相結(jié)合的糖蛋白結(jié)構(gòu)，從而使其生物活性降低甚至消失。比如中國2009年5月13日授權(quán)的200610146291.0號專利“魷魚墨黑色素的制備方法及其應(yīng)用”中所采用酶解與水洗相結(jié)合的方法得到凍干的魷魚墨沉淀粉，在酶解過程中，黑色素-糖蛋白的結(jié)構(gòu)中的蛋白被不同程度的破壞，失去了原有的大分子形態(tài)，生物活性大打折扣；又如中國2014年8月13日授權(quán)的201110112848.X號專利“一種烏賊墨肽聚糖的制備方法和應(yīng)用”中使用有機溶劑脫脂及去除雜蛋白，反應(yīng)條件劇烈，應(yīng)用于食品及其他日用品缺乏有機物殘留數(shù)據(jù)，無法保證其安全性；再如中國2016年7月6日公布的201610072931.1號專利“不溶性及可溶性魷魚墨黑色素的制備方法及應(yīng)用”中使用了強堿NaOH和強酸HCl，獲得的黑色素失去了活性大分子結(jié)構(gòu)，其抗氧化性、提高免疫能力的功能也就隨之消失。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種槍烏賊保健功能性黑色素的提取方法，該方法克服了現(xiàn)有提取技術(shù)造成的槍烏賊黑色素-糖蛋白結(jié)構(gòu)被破壞和生物活性下降的缺點。

本發(fā)明的目的是通過如下措施來達到的。

提取槍烏賊保健功能性黑色素的方法，其特征是：包含如下加工步驟：

（1）原料處理：取冰凍儲存的墨囊，過夜解凍后，加入食物切碎機中將墨囊破碎，加入墨囊重量1-5倍的純化水充分攪拌，使用漏勺將未破碎完全的組織撈出；

（2） 粗濾：用尼龍網(wǎng)初步過濾，濾去不溶解雜質(zhì)、顆粒物，得到粗濾液；

（3）第一次抽濾：粗濾液經(jīng)孔徑為0.45um的混合纖維素濾膜抽濾，得到第一次抽濾液；

（4）第二次抽濾：第一次抽濾液經(jīng)孔徑為0.22um的混合纖維素濾膜抽濾，得到第二次抽濾液；

（5）第一次噴霧干燥：將第二次抽濾液進行噴霧干燥，得到干粉；

（6） 溶解：用純化水將干粉進行溶解；

（7）分離層析：使用透明柱裝填凝膠進行分離，以除去不需要的無機鹽、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，以純化水為洗脫液，肉眼可見黑色色帶緩慢沿層析柱向下移動，收集黑色色帶區(qū)域的洗脫液；

（8）第二次噴霧干燥：將分離層析收得的洗脫液，進行噴霧干燥，噴霧干粉用純化水溶解后，繼續(xù)進行分級分離層析；

（9）分級分離層析：使用較分離層析中的填料分離范圍有一定跨度、交聯(lián)度稍高凝膠的一種、兩種或兩種以上，依次進行分離純化，以盡量多地除去不需要的無機鹽、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，以純化水為洗脫液，收集黑色色帶區(qū)域的洗脫液；

（10）第三次噴霧干燥：將分級分離層析收得的洗脫液，分別進行噴霧干燥，前一級的噴霧干燥粉用純化水溶解后，繼續(xù)進行下一級層析，最后一級噴霧干燥后得保健功能性黑色素。

進一步地，所述步驟（2）粗濾中尼龍網(wǎng)采用200目尼龍網(wǎng)。

進一步地，所述步驟（7）分離層析中采用規(guī)格為Φ60×1000mm玻璃柱裝填Sephadex G-15。

進一步地，所述步驟（9）分級分離層析中采用規(guī)格為Φ60×1000mm玻璃柱裝填Sephadex G-25。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于，充分利用了寶貴的海洋資源，提高了槍烏賊的經(jīng)濟價值。制得的槍烏賊保健功能性黑色素含多種天然營養(yǎng)成分，其中黑色素-糖蛋白總含量達80-90%，還含有少量蛋白多糖復(fù)合體及其單體。整個工藝流程簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)，反應(yīng)條件溫和，不使用有機溶劑，營養(yǎng)成分破壞少，提取的黑色素帶有活性粘多糖天然結(jié)構(gòu)未被破壞，功能性得以全面保留。

具體實施方式

提取槍烏賊保健功能性黑色素的方法包括如下步驟：

（1） 取冰凍儲存的墨囊10kg，過夜解凍后，加入食物切碎機中將墨囊破碎，加入20L純化水于破碎的墨囊中，充分攪拌，使用漏勺將未破碎完全的組織撈出。

（2）用200目尼龍網(wǎng)靜置過濾，濾去組織碎片、殘渣，得到粗濾液22L。

（3）粗濾液經(jīng)孔徑為0.45um的混合纖維素濾膜進行第一次抽濾，得到濾液22L。

（4）第一次抽濾液再經(jīng)孔徑為0.22um的混合纖維素濾膜抽濾，得到濾液22L。

（5）進行第一次噴霧干燥得干粉83g。

（6）將此干粉用400ml純化水進行溶解得1級待分離液410ml。

（7）使用規(guī)格為Φ60×1000mm玻璃柱裝填Sephadex G-15 ，以純化水為洗脫液，上樣1級待分離液，將流速設(shè)定為50ml/min，洗脫流速為2ml/min，收集黑色色帶區(qū)域的洗脫液450ml。

（8） 進行第二次噴霧干燥，得到干粉56g。

（9） 用400ml純化水溶解第二次噴霧干燥干粉得2級待分離液，使用規(guī)格為Φ60×1000mm玻璃柱裝填Sephadex G-25 ，以純化水為洗脫液，上樣2級待分離液，將流速設(shè)定為50ml/min，洗脫流速為2ml/min，收集黑色色帶區(qū)域的洗脫液600ml。

（10）進行第三次噴霧干燥即得到槍烏賊保健功能性黑色素31g。