專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從銀耳栽培廢料中提取黑色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黑色素的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，它適用于銀耳栽培廢料。
背景技術(shù)：
銀耳的袋料栽培是銀耳的主要栽培方法，具有原料廣泛、成本低、周期短、產(chǎn)量高、 銷(xiāo)路好、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，每百公斤培養(yǎng)料干耳產(chǎn)量為8 15公斤。我國(guó)銀耳資源豐富， 銀耳的產(chǎn)量居于世界領(lǐng)先地位，而隨之產(chǎn)生大量的銀耳栽培廢料，對(duì)這些廢料的有效處理成為亟待解決的一個(gè)課題。一方面，如將產(chǎn)后栽培廢料在環(huán)境中自然堆棄，會(huì)滋生多種危害銀耳生產(chǎn)的生物，如各種霉菌、蚊類(lèi)、螨類(lèi)等。另一方面，這些廢料中含有大量可再利用的物質(zhì)，是具有應(yīng)用價(jià)值的再生生物資源。為了達(dá)到生物資源的高效利用，減少環(huán)境污染，國(guó)內(nèi)近年開(kāi)展了很多食用菌栽培廢料的利用研究。綜合其利用情況，可以分為二次種菇、無(wú)土栽培基質(zhì)、菌糠飼料、生物有機(jī)肥、燃料和生物提取6種利用途徑。其中生物提取經(jīng)濟(jì)效益較好，可提高銀耳栽培的附加值，具有非常重要的市場(chǎng)價(jià)值和社會(huì)效益。銀耳袋料栽培廢料的主要成分有銀耳伴生菌香灰菌、40%左右的棉仔殼、10%左右的麥皮，大豆稈、花生稈(殼)、玉米芯以及石膏、尿素、硫酸鎂、麩皮、白糖和黃豆粉等物質(zhì)。黑色素是一類(lèi)由酚或吲哚化合物聚合氧化而成的高分子聚合物。天然黑色素作為一種食用色素，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。近年來(lái)的科學(xué)研究還表明，天然黑色素能清除自由基，阻止心磷脂脂質(zhì)體的氧化，具有抗氧化、抗輻射和延緩衰老等功能，因此它還可以用于生物、醫(yī)藥、化妝品、保健品等行業(yè)和領(lǐng)域。銀耳的袋料栽培是銀耳的主要栽培技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)80%以上的銀耳出于袋料栽培。香灰菌作為銀耳的“伴生菌”，可分解木質(zhì)素和纖維素為銀耳生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，而它自身在生長(zhǎng)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生并分泌大量的黑色素。因此從銀耳栽培廢料中提取黑色素，既達(dá)到了生物資源的高效利用，減少了環(huán)境污染，又具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。目前，黑色素的制備方法主要有3種1)從動(dòng)植物組織中提取黑色素黑色素廣泛存在于動(dòng)植物組織中，以動(dòng)植物組織為原料，根據(jù)黑色素的溶解特性，進(jìn)行黑色素的提取。如專(zhuān)利CN100999616從魷魚(yú)墨中提取黑色素，CN101157805從陰香果皮中提取黑色素，相同類(lèi)型的還有CN101643589和 CN1939979。2)微生物發(fā)酵生產(chǎn)黑色素產(chǎn)黑色素的微生物種類(lèi)主要有細(xì)菌(鏈球菌、蠟狀芽孢桿菌、嗜麥芽假單孢菌)、固氮菌、霉菌(黑曲霉、鏈格孢霉、構(gòu)巢曲霉、米曲霉等)、放線(xiàn)菌 (鏈霉菌)以及真菌(出芽短梗霉)。在適宜培養(yǎng)條件下，利用一種高產(chǎn)黑色素的菌株發(fā)酵生產(chǎn)黑色素。3)酶法合成黑色素酪氨酸是合成黑色素的前體物，酪氨酸在酪氨酸氧化酶的催化作用下氧化生成二羥苯丙氨酸(Dopa)，繼續(xù)氧化生成多巴醌，再進(jìn)一步氧化閉環(huán)生成5，6-二羥吲哚，再轉(zhuǎn)化生成5，6-吲哚二醌，在酶的作用下，最后氧化聚合而形成黑色素。專(zhuān)利 CN101003817以酪氨酸、二元酚、三元酚及其衍生物為底物，在反應(yīng)器中建立酶促反應(yīng)系統(tǒng)， 酶促合成黑色素。上述各種方法中，第一種方法提取工藝條件簡(jiǎn)單，具有一定的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用價(jià)值，但是產(chǎn)品的純度與質(zhì)量不高，并可能存在原料來(lái)源的問(wèn)題。第二種方法具有資源豐富、潛力大、生產(chǎn)周期短，效率高的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)微生物大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的工藝研究還處于初級(jí)階段，相關(guān)技術(shù)不夠成熟，且設(shè)備復(fù)雜，投資巨大。第三種制備方法時(shí)間短，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)參數(shù)可控，但底物或酶制劑成本高或制備較為繁瑣，妨礙了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)之不足，為開(kāi)發(fā)新的天然黑色素和銀耳栽培廢料的綜合利用提供一條新的途徑。在于提供了一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，黑色素安全無(wú)毒、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、純度高，得率高。一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，20 50目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用。(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；(所述的廢料是銀耳袋料栽培廢料的主要成分有銀耳伴生菌香灰菌、40%左右的棉仔殼、10%左右的麥皮，大豆稈、花生稈(殼)、玉米芯以及石膏、尿素、硫酸鎂、麩皮、白糖和黃豆粉等物質(zhì))稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料樣品，按料液重量體積比為1 20 1 50加入相應(yīng)體積的濃度為0. 75 1. 75mol/L的氫氧化鈉溶液，也可用體積濃度為10 20%的氨水，或0. 75 1. 75mol/L的氫氧化鉀，或1. 5 3. 5mol/L的碳酸鈉等作為提取劑。利用超聲波輔助提取，超聲功率40 80W，提取時(shí)間40 80min ；用2 8層紗布過(guò)濾、1 2層定量濾紙過(guò)濾或者3000 IOOOOrpm高速離心將將固液分離，使得銀耳栽培廢料及其它雜質(zhì)分離出去，得到提取液。(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用1 3mol/L鹽酸調(diào)節(jié)提取液的pH值至1. 0 3. 0，然后60 80°C水浴10 18h，使黑色素以沉淀形式析出。也可用體積濃度為20 30%的醋酸，或體積濃度為20 30%的磷酸調(diào)節(jié)提取液的pH值到1. 0 3. 0。(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為7000 lOOOOrpm，(高速冷凍離心機(jī)J-E美國(guó)Beckman公司)時(shí)間為10 15min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為10 301 ，溫度低于_30°C，干燥時(shí)間20 Mh。 也可將離心后的黑色素沉淀置于60 80°C的烘箱中干燥。(5)將黑色素粗品進(jìn)行純化。在0. 1 3. Og黑色素粗品中加入10 30mL體積的5 7mol/L的HCl (前面寫(xiě)明中文，于100°C水浴2 6h，4000 6000rpm離心收集沉淀，沉淀用蒸餾水漂洗1 3次， 溶于pH7. 5 8. 5的KOH中。加入一倍體積的氯仿異戊醇(1:5)，上下顛倒10 20次離心收集上層液體。重復(fù)三次操作。將所收集液體用1 3mol/L HCl調(diào)pH至1. 0 3. 0，離心收集沉淀。沉淀用無(wú)水乙醇、濃度為95%乙醇、濃度為70%乙醇梯度洗滌，再離心收集沉淀。沉淀用去離子水漂洗1 3次，冷凍干燥后存于-20°C冰箱備用，得到黑色素。本發(fā)明通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)分析了影響銀耳栽培廢料中黑色素得率的工藝條件，確定銀耳栽培廢料中黑色素適宜于用1.25mol/L的氫氧化鈉溶液、超聲功率80W、超聲時(shí)間SOmin、料液比1 30提取。在此參數(shù)條件下黑色素粗品得率為15. 436%。本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明采用超聲處理銀耳栽培廢料，破碎香灰菌細(xì)胞，可縮短提取時(shí)間，大大提高黑色素的得率，黑色素粗品得率達(dá)到15. 436%黑色素粗品得率D )的計(jì)算公式如下D(% )=黑色素粗品的質(zhì)量/袋料質(zhì)量X 100%經(jīng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)(表1)發(fā)現(xiàn)，銀耳栽培廢料經(jīng)超聲處理，黑色素的得率明顯提高，因此選用超聲波輔助提取黑色素。經(jīng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)(表2、表3和表4)還發(fā)現(xiàn)，在選用超聲波輔助提取銀耳栽培廢料中黑色素的前提下，超聲功率60W、超聲處理時(shí)間40min、氫氧化鈉濃度lmol/L三個(gè)工藝參數(shù)中， 變動(dòng)其中一個(gè)工藝參數(shù)都會(huì)對(duì)黑色素粗品的得率有較大影響。
表1不同處理對(duì)黑色素粗品得率的影響
處理黑色素粗品得率D (%)60°C水浴40 min4.352高溫高壓處理(118°C，40 min)5.098液氮研磨3.940超聲波輔助提取(超聲功率60 W，40 min)7.942未處理1.516表2不同超聲功率對(duì)黑色素粗品得率的影響超聲功率(W)黑色素粗品得率D (%)404.760507.556608.278709.8588010.768 表3不同超聲處理時(shí)間對(duì)黑色素粗品得率的影響
超聲處理時(shí)間(min)黑色素粗品得率D (%)207.170407.924608.318807.2341007.616表4不同氫氧化鈉濃度對(duì)黑色素粗品得率的影響氫氧化鈉濃度(mol/L)黑色素粗品得率D (%)0.757.2221.008.0341.2510.8781.5010.0261.759.524 2)本發(fā)明提取的黑色素安全無(wú)毒、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、純度高，可作為食品色素應(yīng)用于飲料、糖果、糕點(diǎn)、巧克力、果醬等，也可用作工業(yè)著色劑、染色劑等；抗氧化研究表明，此種黑色素抗氧化能力強(qiáng)于Vc，稍低于合成黑色素，因此也可應(yīng)用于生物、化妝品、保健品等行業(yè)和領(lǐng)域；近年來(lái)的科學(xué)研究還表明，黑色素可以作為新型的天然藥物載體，用來(lái)治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)性疾病，一些可溶性黑色素在體外還具有抑制艾滋病病毒感染宿主細(xì)胞的作用，有可能成為一種有效的藥物。


圖1為一種從銀耳栽培廢料中提取的黑色素粗品的紫外圖譜。其最大吸收峰在209nm處，而從最大吸收峰位置開(kāi)始，隨著波長(zhǎng)增加，吸光值呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)，與黑色素標(biāo)樣的紫外吸收特征基本一致。圖2為一種從銀耳栽培廢料中提取的黑色素粗品的傅里葉紅外變換掃描圖譜。它具有經(jīng)典的黑色素紅外吸收特征，即在3μπι和6μπι處各有一個(gè)吸收峰。其中 3410cm-1的處有寬而強(qiáng)的吸收峰，而在860 650CHT1范圍內(nèi)的吸收帶很弱，與合成黑色素的紅外光譜圖譜相似，也存在一定的區(qū)別。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，20或30或40或50目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用。(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料5. 000g，加入150mL濃度為1. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，超聲波輔助提取(60W，60min)，用2或3或4或5或6或7或8層紗布過(guò)濾，得到提取液。(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用3mol/L鹽酸酸化至pH值為2.0，80°C下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為lOOOOrpm，時(shí)間為15min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為30Pa，溫度低于-30°C，干燥時(shí)間24h。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，可得固體粉末狀的黑色素粗品，再將黑色素粗品進(jìn)行純化。 黑色素粗品的得率為11. 580%。實(shí)施例2 一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，40目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用。(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料5. 000g,加入150mL濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液，超聲波輔助提取(80W，60min)，用2或3或4或5或6或7或8層紗布過(guò)濾，得到提取液。(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用3mol/L鹽酸酸化至pH值為2.0，80°C下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為lOOOOrpm，時(shí)間為15min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為30Pa，溫度低于-30°C，干燥時(shí)間24h。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，可得固體粉末狀的黑色素粗品，再將黑色素粗品進(jìn)行純化。 黑色素粗品的得率為14. 320%。實(shí)施例3 一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，40目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用。(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料5. 000g，加入150mL濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液，超聲波輔助提取(60W，SOmin)，用2或3或4或5或6或7或8層紗布過(guò)濾，得到提取液。(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用3mol/L鹽酸酸化至pH值為2.0，80°C下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。
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(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為lOOOOrpm，時(shí)間為15min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為30Pa，溫度低于-30°C，干燥時(shí)間24h。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，可得固體粉末狀的黑色素粗品，再將黑色素粗品進(jìn)行純化。 黑色素粗品的得率為14. 352%。實(shí)施例4 一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，40目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用。(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料5. OOOg,加入150mL濃度為1. 25mol/L的氫氧化鈉溶液，超聲波輔助提取(80W，SOmin)，用2或3或4或5或6或7或8層紗布過(guò)濾，得到提取液。(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用3mol/L鹽酸酸化至pH值為2.0，80°C下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為lOOOOrpm，時(shí)間為15min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為30Pa，溫度低于-30°C，干燥時(shí)間24h。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，可得固體粉末狀的黑色素粗品，再將黑色素粗品進(jìn)行純化。 黑色素粗品的得率為15. 436%。實(shí)施例5 一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，40目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用。(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料5. 000g,加入150mL濃度為1. 25mol/L的氫氧化鈉溶液，超聲波輔助提取(60W，40min)，用2或3或4或5或6或7或8層紗布過(guò)濾，得到提取液。(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用3mol/L鹽酸酸化至pH值為2.0，80°C下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為lOOOOrpm，時(shí)間為15min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為30Pa，溫度低于-30°C，干燥時(shí)間24h。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，可得固體粉末狀的黑色素粗品，再將黑色素粗品進(jìn)行純化。 黑色素粗品的得率為13. 478%。實(shí)施例6 一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下
(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，40目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用。(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料5. OOOg,加入150mL濃度為1. 50mol/L的氫氧化鈉溶液，超聲波輔助提取(80W，40min)，用2或3或4或5或6或7或8層紗布過(guò)濾，得到提取液。(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用3mol/L鹽酸酸化至pH值為2.0，80°C下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為lOOOOrpm，時(shí)間為15min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為30Pa，溫度低于-30°C，干燥時(shí)間24h。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，可得固體粉末狀的黑色素粗品，再將黑色素粗品進(jìn)行純化。 黑色素粗品的得率為13. 116%。
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權(quán)利要求
1. 一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟如下(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，20 50目過(guò)篩，得到銀耳栽培廢料的干粉備用；(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；稱(chēng)取干燥粉碎的銀耳栽培廢料樣品，按料液重量體積比為1 :20 1 :50加入相應(yīng)體積的濃度為0. 75 1. 75 mol/L的氫氧化鈉溶液，用體積濃度為10 20%的氨水，或0. 75 1. 75 mol/L的氫氧化鉀，或1. 5 3. 5 mol/L的碳酸鈉作為提取劑，利用超聲波輔助提取，超聲功率40 80 W, 提取時(shí)間40 80 min ；將固液分離，用2 8層紗布或?yàn)V紙將銀耳栽培廢料及其它雜質(zhì)分離出去，得到提取液；(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用1 3mol/L鹽酸調(diào)節(jié)提取液的pH值至1. 0 3. 0，然后60 80°C水浴10 18 h，使黑色素以沉淀形式析出，用體積濃度為20 30%的醋酸，或體積濃度為20 30%的磷酸調(diào)節(jié)提取液的pH值；(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；離心的速率為7000 10000 rpm,時(shí)間為10 15 min ；冷凍干燥時(shí)的真空度為10 30 1 ，溫度低于_30°C，干燥時(shí)間20 M h，將離心后的黑色素沉淀置于60 80°C的烘箱中干燥；(5)將黑色素粗品進(jìn)行純化在黑色素粗品中加入體積的5 7mol/L的HCl于100°C 水浴2 6 h，4000 6000 rpm離心收集沉淀，沉淀用蒸餾水漂洗1 3次，溶于pH7. 5 8. 5的KOH中，加入一倍體積的氯仿異戊醇1 :5，上下顛倒10 20次離心收集上層液體， 重復(fù)三次操作，將所收集液體用1 3 mol/L HCl調(diào)pH至1. 0 3. 0，離心收集沉淀，沉淀用無(wú)水乙醇、濃度為95%乙醇、濃度為70%乙醇梯度洗滌，再離心收集沉淀，沉淀用去離子水漂洗1 3次，冷凍干燥后存于_20°C冰箱備用，得到黑色素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從銀耳栽培廢料中提取天然黑色素的方法，其步驟(1)將銀耳栽培廢料粉碎過(guò)篩；采用粉碎機(jī)將干燥的銀耳栽培廢料粉碎，得到銀耳栽培廢料的干粉備用；(2)將粉碎的銀耳栽培廢料用堿溶液提取，過(guò)濾除渣，得到提取液；(3)將提取液酸化，使黑色素沉淀；用鹽酸調(diào)節(jié)提取液的pH值；(4)離心、干燥后得到黑色素粗品；(5)將黑色素粗品進(jìn)行純化在黑色素粗品中加入體積的HCl于水浴，離心收集沉淀，沉淀用蒸餾水漂洗，離心收集上層液體，離心收集沉淀，沉淀用無(wú)水乙醇，再離心收集沉淀，沉淀用去離子水漂洗，冷凍干燥后冰箱備用。方法易行，操作簡(jiǎn)便，黑色素安全無(wú)毒、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、純度高，得率高。
文檔編號(hào)C09B61/00GK102229754SQ20111012210
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者余樂(lè), 吳堯, 李琦, 潘能慶, 蔣志武, 馬愛(ài)民 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)