本發(fā)明涉及一種熒光探針及其制備方法，以及其在水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中檢測RNA和細(xì)胞中核仁成像的用途。

背景技術(shù)：

小分子探針是指針對某種特定目標(biāo)生物分子或生物離子的開發(fā)的探測器，小分子探針能與特定的靶分子進(jìn)行特異性相互作用，并能被特殊的檢測技術(shù)所探知。與普通的檢測技術(shù)相比，探針技術(shù)具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于分子影像和實(shí)時監(jiān)測。

RNA(核糖核酸)在生物體的生長、發(fā)育及凋亡的整個過程中都有重要的調(diào)控作用；在許多疾病的發(fā)生過程中，RNA起著關(guān)鍵作用，如惡性腫瘤的發(fā)生與RNA的表達(dá)異常關(guān)系密切。但與DNA分析與檢測技術(shù)相比，RNA的分析與檢測技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用發(fā)展緩慢。

RNA熒光探針具有在復(fù)雜的溶液體系中或者活細(xì)胞環(huán)境中高選擇性、特異性地識別RNA的優(yōu)點(diǎn)，在RNA分析與檢測領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。目前，已經(jīng)商業(yè)化的RNA熒光探針只有invitrogen公司出品的RNASelect。該熒光探針在實(shí)際成像應(yīng)用中存在一些缺陷，例如與RNA響應(yīng)速度較慢、光致毒性大和光穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，這些缺陷影響其應(yīng)用價值。因此，開發(fā)性能優(yōu)越的小分子熒光探針具有很強(qiáng)的市場價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種熒光探針。

本發(fā)明的另一個目的在于提供上述探針的制備方法。

本發(fā)明的再一個目的在于提供上述探針在檢測水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中RNA的應(yīng)用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明提供了一種熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

式中X^-為陰離子，可以是碘離子、溴離子、對甲苯磺酸離子或三氟甲磺酸離子等。所 述的X^-為N原子甲基化反應(yīng)后的陰離子。

本發(fā)明同時提供了上述探針的制備方法，表示如下：

具體步驟為：先將4-氯-2-甲基喹啉與甲基化試劑反應(yīng)，得到化合物再將2-甲基苯并噻唑與甲基化試劑反應(yīng)，得到然后將和按摩爾比為1∶1-1∶1.3反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25-100℃，反應(yīng)時間為2-5小時，反應(yīng)溶劑為水、甲醇、乙醇中的一種或多種，反應(yīng)在無機(jī)堿存在條件下進(jìn)行，得到中間體最后將和4-甲巰基苯甲醛按摩爾比為1∶2-1∶3反應(yīng)，反應(yīng)溫度為130-150℃，反應(yīng)時間為2-5小時，反應(yīng)溶劑為正丁醇，以4-甲基哌啶或者哌啶為催化劑，進(jìn)行在縮合反應(yīng)，得到最終探針化合物

本發(fā)明的另一個目的還提供了上述探針在檢測水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中RNA的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的熒光探針在標(biāo)記或顯示RNA和核仁在活細(xì)胞中分布的應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，利用本發(fā)明所述熒光探針標(biāo)記后的熒光圖像顯示，在細(xì)胞質(zhì)和核仁區(qū)有明顯的綠光分布，明確提示所述探針能夠在活細(xì)胞中專一性的成像胞質(zhì)和核仁中的RNA，并且在與傳統(tǒng)核仁熒光探針或與經(jīng)RNA酶消化實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞進(jìn)行對比試驗(yàn)后也得到進(jìn)一步的證實(shí)。

本發(fā)明提供的熒光探針是一類新型的RNA選擇性識別熒光探針分子，與其功能相近的熒光探針比，本發(fā)明所述探針具有低生物毒性、膜通透性好、顯色強(qiáng)、復(fù)染兼容性好、光穩(wěn)定性較強(qiáng)的特點(diǎn)，預(yù)示其作為RNA和核仁熒光探針具有廣泛的應(yīng)用，有望開發(fā)為RNA和核仁相關(guān)的生理和病理學(xué)研究用簡捷、直觀的生物檢測試劑。

附圖說明

圖1為為探針6a與AT、DA21、LQ1、Oxy28、random、RNA六種核酸在1∶1濃度下的熒光譜。

圖2為探針6a滴定四鏈DNA、雙鏈DNA、RNA的熒光數(shù)據(jù)的擬合曲線。

圖3為探針6a滴定RNA的熒光光譜

圖4為探針6a滴定RNA的熒光光譜中C與(F-F₀)/F₀擬合的曲線..

圖5為探針6a與DNA與RNA凝膠電泳圖.

圖6為探針6a與染料DAPI復(fù)染PC3細(xì)胞的細(xì)胞成像圖

圖7為探針6a與E36與RNA染料在DNase與Rnase處理之后染PC3細(xì)胞

具體實(shí)施方式

以下通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。通過熒光光譜實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明涉及的化合物6a由于具有較大的電子共軛體系和平面，與RNA發(fā)生特異性的堆積作用后，熒光光譜發(fā)生明顯變化，熒光強(qiáng)度增加百倍，甚至只需普通紫外燈照射下，肉眼觀察，同時與其他的核酸作用較弱，沒有明顯的熒光信號響應(yīng)，使該類探針具有很好的特異性識別作用。所以，我們將該探針與不同的核酸混合時，當(dāng)該核酸為RNA時，其與探針分子間的特異性作用，產(chǎn)生熒光光譜的改變。當(dāng)核酸為DNA(G-四鏈體，雙鏈，單鏈)時，則不會產(chǎn)生明顯的信號變化。以其中化合物6a為例來說明本發(fā)明的熒光探針在熒光法(包括熒光顯微鏡和熒光凝膠成像儀)檢測水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中RNA的應(yīng)用

實(shí)施例一：化合物2的合成

往25ml圓底燒瓶里稱取4-氯-喹哪啶0.2g(1.1236mmol)，加入6倍摩爾量的碘甲烷約0.96g，環(huán)丁砜1.5ml，將混合物加熱到50℃，反應(yīng)18個小時后，冷卻，加入無水乙醚后震蕩，抽濾，固體用無水乙醚洗滌，真空干燥后稱重，得到0.345g化合物2，產(chǎn)率為95.8％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.56(d，J＝8.4Hz，1H)，8.46(d，J＝8.3Hz，1H)，8.22(t，J＝8.1Hz，1H)，8.01(t，J＝7.9Hz，1H)，7.55(s，J＝7.4Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.74(s，1H)，2.68(s，3H)。

實(shí)施例二：化合物4的合成

往25ml的圓底燒瓶里稱取2-甲基-苯并噻唑0.25g(1.68mmol)，加入6倍摩爾量的碘甲烷約1g、無水乙醇5ml，80℃下反應(yīng)15個小時后，將反應(yīng)后的溶液冷卻至室溫，然后加入無水乙醇和三氯甲烷各5ml，振蕩后抽濾，并用少量乙醇和三氯甲烷洗滌沉淀，真空干燥后得到化合物4為白色粉末狀固體0.448g，收率為91.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.44(d，J＝8.1Hz，1H)，8.30(d，J＝8.4Hz，1H)，7.90(t，J＝7.8Hz，1H)，7.81(t，J＝7.7Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.54(s，1H)，3.17(s，3H)。

實(shí)施例三：化合物5的合成

稱取化合物2和4各0.50g，加入到裝有10ml甲醇的圓底燒瓶中，室溫條件下攪拌6分鐘后加入2ml 0.5mol/L碳酸氫鈉水溶液，室溫?cái)嚢杓s1小時。向反應(yīng)后的溶液中加入4ml飽和KI溶液，攪拌約15分鐘后抽濾，再用10ml水洗，4ml丙酮洗滌，最終得到磚紅色固體，干燥后得到0.98g化合物5，產(chǎn)率為81.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.77(d，J＝8.3Hz，1H)，8.18(d，J＝8.7Hz，1H)，8.02-7.96(m，2H)，7.74(d，J＝8.2Hz，2H)，7.59(t，J＝7.7Hz，1H)，7.39(t，J＝7.5Hz，1H)，7.34(s，1H)，6.85(s，1H)，4.07(s，3H)，3.98(s，3H)，2.87(s，3H)。

實(shí)施例四：化合物6a的合成

稱取0.0715g(0.160mmol)的5于25ml的圓底燒瓶中，加入2倍摩爾量的4-甲硫基苯甲醛0.049g、正丁醇1.5ml、4-甲基哌啶5滴，在130～135℃下反應(yīng)3個小時，冷卻后抽濾，用正丁醇洗滌固體，干燥稱重后得66mg，產(chǎn)率71％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.73(d，J＝7.8Hz，1H)，8.14(d，J＝8.4Hz，1H)，8.06-8.02(m，1H)，8.00-7.95(m，1H)，7.87(d，J＝8.5Hz，2H)，7.76-7.68(m，3H)，7.64(s，1H)，7.61-7.55(m，2H)，7.42-7.35(m，3H)，6.87(s，1H)，4.13(s，3H)，3.97(d，J＝3.7Hz，3H)，2.56(s，3H)。

實(shí)施例五：熒光探針6a對不同核酸選擇性的熒光光譜實(shí)驗(yàn)

將5mM的化合物儲備液稀釋成5uM的濃度，再加入不同種類的核酸用熒光分光光度計(jì)(狹縫寬度10nm，掃描速度200nm/min，激發(fā)波長475nm)測出其各自的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)熒光探針6a與RNA的結(jié)合之后熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。

選擇性實(shí)驗(yàn)中所使用的核酸

實(shí)施例六：熒光探針6a對不同核酸的熒光滴定實(shí)驗(yàn)

將5mM的化合物儲備液稀釋成5μM的濃度，放置于熒光分光光度計(jì)中，逐漸增加溶液中不同核酸的濃度，并進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。測定條件為：狹縫寬度10nm，掃描速度200nm/min，激發(fā)波長475nm。

熒光滴定實(shí)驗(yàn)中所使用的核酸

實(shí)施例七：熒光探針6a對RNA檢測限的測定

將5mM的化合物儲備液稀釋成5μM的濃度，再在熒光分光光度計(jì)(狹縫寬度10nm，掃描速度200nm/min，激發(fā)波長475nm)掃描，再往其中慢慢加入RNA做到使其飽和.檢測限的計(jì)算公式

LOD＝K×S_b/m

LOD(化合物的結(jié)合常數(shù))，m是濃度C與(F-F0)/F0的所做直線的斜率，S_b為用儀器空白多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K值按照國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會建議通常取為3，6a測得的LOD為6μg/L。

實(shí)施例八：噻唑橙苯乙烯類化合物的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

先將細(xì)胞接種于6孔板中，使細(xì)胞的密度約為2×10³個/mL，然后在37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)24h。接著棄去上步6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，然后再加入預(yù)冷的純甲醇1.5mL常溫避光放置1min，最后棄去純甲醇并再用預(yù)冷的1×PBS洗3次，加入1mL的5μM的化合物然后放置15min。棄去上步6孔板中的化合物溶液，用預(yù)冷的1×PBS洗 3次，在上述6孔板中加入1μM的DAPI溶液1mL并37℃放置2min，然后再用預(yù)冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況.

實(shí)施例九：噻唑橙苯乙烯類化合物的Rnase與DNase細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

先將細(xì)胞接種于6孔板中，使細(xì)胞的密度約為2×10³個/mL，然后在37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)24h。接著棄去上步6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，然后再加入預(yù)冷的純甲醇1.5mL常溫避光放置1min，最后棄去純甲醇并再用預(yù)冷的1×PBS洗3次，加入1mL的5uM的化合物然后放置15min。棄去上步6孔板中的化合物溶液，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，在六孔板中分別加入1mL DNase，DNase-Free RNase的溶液并37℃，5％CO₂培養(yǎng)3h.棄去6孔板中的酶溶液，再用預(yù)冷的1×PBS洗3次，每次浸泡5min。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況.

實(shí)施例十：核酸凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

先將5×TBE電泳緩沖液、過硫酸銨10％m/V、6X載樣緩沖液、亞甲雙丙酰胺(29∶1)(％，m/V)配好，接著安裝電泳裝置和配置凝膠溶液，灌制凝膠，待凝膠冷卻之后取出梳子和隔板，放入電泳槽中，緩沖液淹沒過膠1-2mm為止，DNA樣品配成5μM(混合液中上樣緩沖液為1X)，RNA配成5mg/L，分別取10uL加入凝膠點(diǎn)樣孔中，將整個電泳儀接通，45V電壓跑1h，接著100V電壓跑3h，取出凝膠塊，再將凝膠塊放入染色劑和化合物中泡染，染過之后吹干，將其置于凝膠電泳儀上觀察。