專利名稱：一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于黑色素溶解度改性方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及將粒毛盤菌(Iachnum)胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法。
背景技術(shù)：
黑色素作為一類廣泛存在于自然界中的色素,是目前已知生物色素中來源較廣泛的色素之一，主要產(chǎn)生于動植物和微生物的進(jìn)化過程中，是通過多羥基酚氧化而成的構(gòu)造不規(guī)則的類多酚聚合體。根據(jù)結(jié)構(gòu)上的差異，可分為真黑色素(eumelanins)、棕黑色素 (phaeomelanins)以及異黑色素(allomelanins)三種類型。黑色素的性質(zhì)比較穩(wěn)定。據(jù)《細(xì)胞微生物學(xué)》(CellularMirobiology，2003, 5，167-223)介紹，黑色素常與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合，且不溶于水。中國專利號ZL200910145058.4《一種粒毛盤菌及由其液態(tài)發(fā)酵制備黑色素的方法》公開了本發(fā)明人課題組以保藏編號為CCTCC No:M 209193的一株粒毛盤菌(Iachnum)YM-223 (本發(fā)明人課題組自定編號代碼)制備黑色素的方法。所制備的黑色素具有較強(qiáng)的抗氧化活性和光保護(hù)作用，且經(jīng)過毒理性試驗(yàn)證實(shí)其安全無毒，同時該粒毛盤菌黑色素在pH彡7時穩(wěn)定，pH彡6時沉淀，其在(T40°C的水中溶解度為0. 03^0. 12g/100g。由于該該粒毛盤菌黑色素在水中的難溶性使其在醫(yī)療、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。若能將堿溶性黑色素改性成水溶性黑色素，以便于人體吸收，可充分發(fā)揮其保健功能，具有重大意義。目前，國際上對黑色素進(jìn)行改性的研究很少。《生物化學(xué)與生物物理學(xué)》(Archivesofbiochemistry and biophysics, 1984, 2, 157-162)曾報道對以化學(xué)方法合成的黑色素進(jìn)行甲基化修飾，并經(jīng)紅外光譜和電子自旋共振光譜檢測，結(jié)果表明兩者有一定區(qū)別，甲基化黑色素具有較多的重氮甲烷成分。除此之外還未見有其他黑色素改性的報道，且至今尚未見到有關(guān)真菌黑色素改性或?qū)⒉蝗苡谒暮谏赝ㄟ^改性獲得水溶性黑色素方面研究的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將保藏號為CCTCCNo:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)的胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷。本發(fā)明將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，其特征在于將保藏號為CCTCC No:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)發(fā)酵后提取純化制得的胞外黑色素，與精氨酸或組氨酸或賴氨酸，和水，按質(zhì)量比為1:0. 5^1. 5:4. 5^50的比例混合,震蕩至黑色素固體溶解后，將該溶液干燥，即得到水溶性粒毛盤菌黑色素。所述干燥可選用冷凍干燥、常溫干燥、真空干燥或噴霧干燥。采用本發(fā)明上述方法得到的改性粒毛盤菌黑色素，在(T40°C的水中溶解度由原來改性前的0. 03 0. 12g/100g提高到了改性后的3. 85 4. 65g/100g。采用本發(fā)明方法可以克服原保藏號為CCTCC No:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)胞外黑色素由于難溶于水而不適合用于制成口服制劑或食品添加劑用于醫(yī)療、食品等領(lǐng)域的問題，對于擴(kuò)展黑色素的應(yīng)用領(lǐng)域和適用范圍具有積極意義。


圖I為改性前的原粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素的紅外光譜圖；圖2為采用本發(fā)明方法對粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素采用精氨酸進(jìn)行改性后的黑色素的紅外光譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
本實(shí)施例中所使用的粒毛盤菌胞外黑色素，是根據(jù)中國專利號ZL200910145058. 4《一種粒毛盤菌及由其液態(tài)發(fā)酵制備黑色素的方法》，由保藏號為CCTCC No:M209193的粒毛盤菌(Iachnum) YM-223發(fā)酵后提取純化制得的。先將保藏號為CCTCC No:M 209193的粒毛盤菌(lachnum)YM_223純培養(yǎng)物接種于配方為按質(zhì)量百分比由葡萄糖1%、蛋白質(zhì)I. 0%、L-酪氨酸0. 03%、K2HPO4O. 1%、CuSO4O. 03%、瓊脂15-20%和蒸餾水IOOOmL組成的，pH 6. 0-7. 0的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的平板上活化，在23°C恒溫培養(yǎng)5天后，取菌齡一致的菌塊接種于裝有50ml配方為按質(zhì)量百分比由葡萄糖1_4%、蛋白質(zhì) 0. 5-1. 0%、L-酪氨酸 0. 03-0. 1%, K2HP040. 03-0. 1%、CuS040. 01-0. 05% 和蒸餾水IOOOmL組成的，pH 6. 0-7. 0的粒毛盤菌YM-223馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在25°C、以160r/min搖床培養(yǎng)5天后，得到粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193種子液。將該粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的4%接種于5L自動控制發(fā)酵罐，其中的發(fā)酵培養(yǎng)基同為上述粒毛盤菌YM-223馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，裝液量為3L，通氣量為2L/min，在28°C、以180r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)10天后，抽濾2次，所得到的濾液即為發(fā)酵液。將發(fā)酵液按體積比I: I與2mol/L的氫氧化鈉溶液混合成為浸提液，靜置12小時，用lmol/L鹽酸甲醇調(diào)節(jié)pH值至2 3，靜置12小時，將所得到的黑色素懸浮液置于高速離心機(jī)中，5，000r/min離心IOmin,所得沉淀經(jīng)去離子水洗漆至pH值為7后，用真空冷凍干燥機(jī)在_42'45°C溫度、5 13Pa壓力條件下真空冷凍干燥后，得到黑色素粗提物。再按該黑色素粗提物的質(zhì)量(g)與濃度為6mol/L鹽酸溶液的體積(ml)比為I ::40，在80°C水浴酸解4小時后，所得沉淀用去離子水洗滌至pH值為7后，置于高速離心機(jī)中，以5，000r/min離心15min，將沉淀按質(zhì)量(g)與濃度為2mol/L的氨水溶液的體積(ml)比為1:10溶于氨水溶液中，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去氨氣至溶液pH值為7，將所得溶液先與石油醚按體積比1:1萃取3次，再與氯仿按體積比1:1萃取3次，最后與乙酸乙酯按體積比1:1萃取3次，所得萃取液用2mol/L鹽酸甲醇溶解調(diào)至pH值為2，用高速離心機(jī)以5，000r/min離心lOmin，棄上清液，所得沉淀經(jīng)去離子水反復(fù)洗滌至pH值為7后，用真空冷凍干燥機(jī)在-42'45°C溫度、5 13Pa壓力條件下真空冷凍干燥后，即得到粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素。分別取Ig粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素，分別加入0. 5g的
下列氨基酸天門冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸和甘氨酸，其中一份作為對照不加入氨基酸，再分別加入IOOmL蒸餾水中，在40°C震蕩30min。采取5000r/min離心IOmin后收集上清液，測其在波長OD5tltl下的分光光度值，光度值越高表明溶解效果越好。結(jié)果表明采用不同氨基酸改性修飾后的黑色素的溶解度相差較大，其中以精氨酸改性修飾的黑色素吸光度最大，OD500為0. 357 ;而以賴氨酸和組氨酸改性修飾的黑色素OD5tltl分別為0. 137和0. 106，其溶解效果次于以精氨酸改性修飾的黑色素；而以天門冬氨酸、蘇氨酸、色氨酸和甘氨酸修飾的黑色素的溶解效果較差，其OD5tltl均低于0. 05。分別取Ig粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素，分別加入0. 25g、0. 5g、0. 75g、l. 0g、l. 25g和I. 5g精氨酸，再分別溶于IOOmL蒸餾水中，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同上。結(jié)果表明當(dāng)精氨酸加入量增加時其改性黑色素溶解量增大，且當(dāng)精氨酸添加量為I. Og時，其改性黑色素可完全溶解，OD值達(dá)最大，繼續(xù)加大精氨酸量，則OD值不再增加。故選擇最佳精氨酸改性修飾黑色素的質(zhì)量比為黑色素精氨酸為1:1。取IOg粒毛盤菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素于三角瓶中，加入IOg精氨酸及IOOmL蒸餾水，在40°C震蕩至黑色素溶解，用真空冷凍干燥機(jī)在-42 _45°C溫度、5 13Pa壓力條件下真空冷凍干燥后，即得到精氨酸修飾的粒毛盤菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外精氨酸黑色素(以下簡稱為精氨酸黑色素)。對其進(jìn)行復(fù)溶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明精氨酸黑色素復(fù)溶效果較好，在40°C水中的溶解度為4. 65g/100g，在0°C水中的溶解度為 4. 38g/100g。分別將采用上述方法改性后的與改性前的2mg粒毛盤菌(lachnum) CCTCCNo:M209193胞外黑色素，分別與400mg干燥的KBr混勻壓片，采用FT-IR6700傅立葉變換紅外光譜儀于^OO^OOcnT1區(qū)間進(jìn)行紅外光譜測定。圖I為改性前原粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外黑色素的紅外光譜圖，圖2為采用本發(fā)明方法對粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素采用精氨酸進(jìn)行改性修飾后的黑色素的紅外光譜圖。對比分析這兩個紅外光譜圖的結(jié)果表明，改性前后的粒毛盤菌(lachnum)CCTCCNo:M 209193胞外黑色素均具有真菌黑色素具有的特征吸收峰，即3218cm—1和1614cm—1處的C=O和-O(N)H基團(tuán)特征吸收峰，除具有相似的O-H伸縮振動(3218. 802cm^)和脂肪族C-H的伸縮振動(2923. 404CHT1和2811. 457cm—1)外，精氨酸黑色素還具有酰胺C=O收縮振動(1672. 346cm-1 和 1637. 679cm_l)、和酰胺 C-N 伸縮振動(1359. 614cm-1 和 1328. 842cm_l)特征吸收峰，這是由于精氨酸與黑色素結(jié)合后，精氨酸的胍基與黑色素的羰基反應(yīng)形成了酰胺。該結(jié)果表明精氨酸對粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外黑色素改性成功。準(zhǔn)確稱量L OOOg粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素，加入ImLlmol L^1NH3 H2O搖勻后，加水定容于IOOmL的容量瓶中，取ImL色素溶液稀釋一定倍數(shù)，在212nm波長下測得吸光度值K。計(jì)算得其色價Ewlcm為221. 0 ;準(zhǔn)確稱量I. OOOg改性后的粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外精氨酸黑色素，加水定容于IOOmL的容量瓶中，取ImL色素溶液稀釋一定倍數(shù)，在202nm波長下測得吸光度值A(chǔ)2。根據(jù)公式計(jì)算色價
AU
C = ，其中A為吸光度值，B為稀釋倍數(shù)，M為色素質(zhì)量。測得其色價E15tlcmS 194. 6。兩
者相比，其中改性后的粒毛盤菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外精氨酸黑色素的色價略低，但仍為桂花種子黑色素色價(El%lcmlmax=60. 24)(據(jù)《Food Science and Technology》(食品科學(xué)與技術(shù)，2006，39:496-502)報道)的3. 23倍(色價高更有利于工業(yè)生產(chǎn))。
實(shí)施例2:取實(shí)驗(yàn)室中原先保留下來的由他人按中國專利號為ZL200910145058. 4的專利《一種粒毛盤菌及由其液態(tài)發(fā)酵制備黑色素的方法》中所述的方法制備獲得的粒毛盤菌(lachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素IOg于三角瓶中，加入IOg賴氨酸及IOOmL蒸餾水，震蕩至使黑色素溶解后，將該溶液在_42'45°C、壓力為5 13Pa的條件下真空冷凍干燥后，即得到以賴氨酸改性修飾的粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素(以下簡稱為賴氨酸黑色素)。按實(shí)施例I中所述方法對賴氨酸黑色素的溶解度及色價進(jìn)行測定，測得其在40°C的水中溶解度為4. 23g/100g，在(TC的水中溶解度為3. 94g/100g，略低于實(shí)施例I中制備的精氨酸黑色素。并測得賴氨酸黑色素的色價E15tlcm等于192. 7，與精氨酸黑色素相當(dāng)。
實(shí)施例3:將IOg粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素置于三角瓶中，加入IOg組氨酸及IOOmL蒸餾水，攪拌后放置至黑色素溶解，將該溶液在_42'45°C、5 13Pa的條件下真空冷凍干燥后，即得到以組氨酸改性修飾的粒毛盤菌(lachnum) CCTCC No:M209193胞外黑色素(以下簡稱為組氨酸黑色素)。按實(shí)施例I的方法對組氨酸黑色素的溶解度及色價進(jìn)行測定，測得其在40°C的水中溶解度為3. 97g/100g,在0°C的水中溶解度為3. 85g/100g,略低于實(shí)施例I中制備的精氨酸黑色素，與實(shí)施例2中制備的組氨酸黑色素相當(dāng)。并測得該組氨酸黑色素的色價E15tlran等于203. 3，略高于精氨酸黑色素與賴氨酸黑色素。在保持上述實(shí)施例1、2及3中其他條件不變的情況下，將粒毛盤菌胞外黑色素純品與精氨酸、賴氨酸或組氨酸的比例擴(kuò)大到1:0. 5^1:1. 5，所得到的精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度與原實(shí)施例1、2及3中制備的精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度相同，并未發(fā)生改變。在保持上述實(shí)施例1、2及3中其他條件不變的情況下，將粒毛盤菌胞外黑色素純品與水的比例擴(kuò)大到1:4. 5 1:50，所得精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度與原實(shí)施例1、2及3中相同，并未發(fā)生改變。在保持上述實(shí)施例1、2及3中其他條件不變的情況下，分別采用常溫干燥、真空干燥或噴霧干燥的方法，所得到的精氨酸黑色素、賴氨酸黑色素及組氨酸黑色素的溶解度相同，并未發(fā)生改變。
權(quán)利要求
1.一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，其特征在于將保藏號為CCTCCNo:M 209193的粒毛盤菌(Iachnum)發(fā)酵后提取純化制得的胞外黑色素，與精氨酸或組氨酸或賴氨酸，和水，按質(zhì)量比為1:0. 5^1. 5:4. 5^50的比例混合,震蕩至黑色素固體溶解后，將該溶液干燥，即得到水溶性粒毛盤菌黑色素。
2.如權(quán)利要求I所述將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，特征在于所述干燥選用冷凍干燥、常溫干燥、真空干燥或噴霧干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，特征是將保藏號為CCTCCNo:M 209193的粒毛盤菌(lachnum)發(fā)酵后提取純化制得的胞外黑色素，與精氨酸或組氨酸或賴氨酸，和水，按質(zhì)量比為1:0.5~1.5:4.5~50混合，震蕩至黑色素固體溶解后，將該溶液干燥，即得到水溶性粒毛盤菌黑色素。采用本發(fā)明方法改性后的粒毛盤菌胞外黑色素在0~40℃水中的溶解度提高到了3.85~4.65g/100g。采用本發(fā)明方法可以克服原粒毛盤菌胞外黑色素因難溶于水而不適合用于口服制劑或食品添加劑的問題，對于擴(kuò)展黑色素的應(yīng)用范圍具有積極意義。
文檔編號C09B61/00GK102746705SQ20121021840
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者盧瑩, 葉子揚(yáng), 葉明 , 郭賡藝 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)