專利名稱：鋅熒光探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性捕集鋅離子并發(fā)出熒光的鋅熒光探針。
背景技術(shù)：
鋅在人體內(nèi)是僅次于鐵含量多的必須金屬元素，細(xì)胞內(nèi)大部分的鋅離子和蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合，與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)保持和機(jī)能表現(xiàn)有關(guān)。另外，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)極其微量存在的游離鋅離子(通常是μM水平以下)的生理作用，也有種種的報(bào)導(dǎo)。特別是，一般認(rèn)為鋅離子和細(xì)胞死因之一的細(xì)胞程序死亡有很深的關(guān)系，也有阿爾茲海默病促進(jìn)老人斑形成等報(bào)導(dǎo)。
以往，為了測(cè)定組織內(nèi)的鋅離子，特異性捕集鋅離子并形成絡(luò)合物，使用隨著絡(luò)合物的形成而發(fā)出熒光的化合物(鋅熒光探針)。作為鋅熒光探針，例如已經(jīng)實(shí)用化的TSQ(Reyes，J.G.等人，Biol.Res.，27，49，1994)、Zinquin乙酯(Tsuda，M.等人，Neurosci.，17，6678，1997)、丹磺?；被一h(huán)楞胺(Koike，T等人，J.Am.Chem.Soc.，118，12686，1996)、Newport Green(作為Molecular Probe公司的商品目錄的“Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals”第6版，Richard P.haugland pp.531-540)等。 但是，使用TSQ、Zinquin或者丹磺?；被一h(huán)楞胺的測(cè)定由于需要使用短波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光(激發(fā)波長(zhǎng)分別是367nm、368nm和323nm)，在將這些鋅熒光探針用于生物體系統(tǒng)的測(cè)定時(shí)，由短波長(zhǎng)產(chǎn)生的激發(fā)可能引起細(xì)胞傷害(細(xì)胞工學(xué)，17，pp.584-595，1998)，另外，測(cè)定時(shí)，細(xì)胞系統(tǒng)自體易于受到具有的自體熒光(NADH和黃素類發(fā)出的熒光)產(chǎn)生的影響這樣的問題。而且，丹磺酰氨基乙基環(huán)楞胺在測(cè)定時(shí)具有由于試劑存在的環(huán)境的差別，即溶劑的種類或者在細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞膜等中的水溶性、脂溶性等的環(huán)境的差別，而使熒光強(qiáng)度發(fā)生很大變化這樣的缺點(diǎn)(蛋白質(zhì)·核酸·酶·增刊號(hào)，42，pp.171-176，1997)，TSQ也具有由于脂溶性高而使細(xì)胞全體均勻分布困難這樣的問題。Newport Green雖然可以用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定，但是具有和鋅離子的親和性低，不具有實(shí)用的測(cè)定靈敏度這樣的問題。因而，一直在謀求開發(fā)不會(huì)引起細(xì)胞障礙且可以高靈敏度測(cè)定鋅離子的鋅熒光探針。
發(fā)明公開本發(fā)明的課題在于提供可以作為高靈敏度的鋅熒光探針而加以利用的化合物或者其鹽。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的課題是提供一種化合物，該化合物可以特異性捕集鋅離子，捕集后絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度優(yōu)良，可以作為能夠用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光測(cè)定的鋅熒光探針而加以利用。再者，本發(fā)明另外的課題在于提供含有具有上述特征的化合物的鋅熒光探針以及使用該鋅熒光探針的鋅離子的測(cè)定方法。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題，進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了以環(huán)狀胺或者聚胺為取代基的化合物對(duì)于鋅離子具有高的特異性，捕集鋅離子，形成用長(zhǎng)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的激發(fā)光發(fā)出強(qiáng)的熒光的絡(luò)合物(特愿平11-40325)。本發(fā)明者們進(jìn)一步反復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)了用下述通式(I)表示的化合物極其迅速地形成和鋅的絡(luò)合物，發(fā)出強(qiáng)的熒光。還發(fā)現(xiàn)了如果用下述通式(I)表示的化合物作為鋅熒光探針，則和生物體內(nèi)的鋅離子即刻反應(yīng)，由于形成熒光性的絡(luò)合物，可以極其正確且高靈敏度地測(cè)定生物體內(nèi)的鋅。基于這些知識(shí)，完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了用下述通式(IA)或(IB)表示的化合物或其鹽 [式中，R1和R2分別獨(dú)立地表示氫原子或者用下述式(A)表示的基團(tuán) (式中，X1、X2、X3和X4分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基、2-吡啶甲基或者氨基的保護(hù)基，m和n分別獨(dú)立地表示0或1)，R1和R2不能同時(shí)是氫原子；R3和R4分別獨(dú)立地表示氫原子或者鹵原子；R5和R6分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基，R7表示氫原子或者烷基]。
作為上述發(fā)明優(yōu)選的方式，提供用下述通式(II)表示的化合物或其鹽 (式中，R13和R14分別獨(dú)立地表示氫原子或鹵原子；R17表示氫原子或烷基；R18表示氫原子或氨基的保護(hù)基)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方式，可以提供R17和R18是氫原子的上述化合物或其鹽，根據(jù)更優(yōu)選的方式，可以提供對(duì)于用-COOR17表示的基團(tuán)，苯環(huán)上的取代氨基結(jié)合到間位或?qū)ξ簧系幕衔锘蚱潲}。
另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供用下述通式(IIIA)或(IIIB)表示的化合物或其鹽 [式中，R21和R22分別獨(dú)立地表示氫原子或用下述式(B)表示的基團(tuán)， (式中，X11、X12、X13和X14分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基、2-吡啶基甲基或者氨基的保護(hù)基，p和q分別獨(dú)立地表示0或1)，R21和R22不能同時(shí)是氫原子；Y表示-CO-NH或-NH-CO-；R23和R24分別獨(dú)立地表示氫原子或鹵原子；R25和R26分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基；R27表示氫原子或烷基]。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方式，可以提供對(duì)于用-COOR27表示的基團(tuán)(形成內(nèi)酯環(huán)時(shí)對(duì)應(yīng)的羰基)，苯環(huán)上的Y結(jié)合到間位上的化合物。
從另外的觀點(diǎn)來(lái)看，根據(jù)本發(fā)明，可以提供含有用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保護(hù)基的化合物除外)或者含有這些化合物的鹽的鋅熒光探針；以及由上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保護(hù)基的化合物除外)或者這些化合物的鹽和鋅離子形成的鋅絡(luò)合物。該鋅熒光探針可以用于測(cè)定組織和細(xì)胞內(nèi)的鋅離子。
從進(jìn)一步的觀點(diǎn)來(lái)看，根據(jù)本發(fā)明，可既提供了鋅離子的測(cè)定方法，也提供了將用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保護(hù)基的化合物除外)或者這些化合物的鹽用作鋅熒光探針的方法；鋅離子的測(cè)定方法，其特征在于包含以下工序(a)使上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保護(hù)基的化合物除外)或者這些化合物的鹽和鋅離子反應(yīng)的工序，以及(b)測(cè)定在上述工序中生成的鋅絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度的工序；并且將上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保護(hù)基的化合物除外)或者這些化合物的鹽用作鋅熒光探針。
用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是只限于引入氨基的保護(hù)基的化合物)作為用于制造上述鋅熒光探針的中間體是有用的。
圖面的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1表示本發(fā)明的鋅熒光探針(化合物6)對(duì)于鋅離子具有優(yōu)良的選擇性。
圖2表示本發(fā)明的鋅熒光探針(化合物12)對(duì)于鋅離子具有優(yōu)良的選擇性。
圖3表示本發(fā)明的鋅熒光探針(化合物21)對(duì)于鋅離子具有優(yōu)良的選擇性。
圖4表示將本發(fā)明的鋅熒光探針(化合物6和化合物12)的熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化和具有環(huán)狀聚胺部分的ACF-1進(jìn)行比較的結(jié)果。
圖5表示本發(fā)明的鋅熒光探針(化合物6和化合物12)的熒光強(qiáng)度和鋅離子濃度的關(guān)系。
圖6表示化合物12以及化合物21和它們的鋅絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度的變化對(duì)于pH的變化。
圖7表示使用大鼠的海馬切片來(lái)研究由缺血刺激產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的變化的結(jié)果。
圖8表示使用大鼠的海馬切片來(lái)研究在不同區(qū)域由缺血刺激產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的變化的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式將日本國(guó)專利申請(qǐng)的2000-50869號(hào)說(shuō)明書公開的全部作為參考，包含在本說(shuō)明書的公開中。
在本說(shuō)明書中，“烷基”或者含有烷基部分的取代基(例如烷基羰基或烷基羰基氧基甲基等)的烷基部分是指例如碳原子數(shù)為1-12個(gè)，優(yōu)選碳原子數(shù)1-6個(gè)，優(yōu)選碳原子數(shù)1-4個(gè)的直鏈、支鏈、環(huán)狀、或者它們的組合組成的烷基。更具體地說(shuō)，作為烷基，優(yōu)選低級(jí)烷基(碳原子數(shù)1-6個(gè)的烷基)。作為低級(jí)烷基，例如可以列舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、環(huán)丙基甲基、正戊基、正己基等。在本說(shuō)明書中，在鹵原子的情況下，氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子都可以，優(yōu)選氟原子、氯原子或溴原子。
對(duì)氨基保護(hù)基的種類沒有特別的限定，例如可以適當(dāng)利用對(duì)硝基苯磺酸基、三氟乙?；?、三烷基甲硅烷基等。關(guān)于氨基的保護(hù)基，例如可以參照“有機(jī)合成中的保護(hù)基”，T.W.Green著，John Wiley & Sons有限公司(1981年)等。
在上述通式(IA)和(IB)中，在苯環(huán)上取代的R1和R2的位置沒有特別的限定。R2是氫原子時(shí)，優(yōu)選R1對(duì)于用-COOR7表示的基團(tuán)(形成內(nèi)酯環(huán)時(shí)對(duì)應(yīng)的羰基)結(jié)合在間位或?qū)ξ簧?。通?II)的苯環(huán)上取代的氨基的位置沒有特別的限定，優(yōu)選相對(duì)于用-COOR17表示的基團(tuán)，是間位或?qū)ξ?。在通?IIIA)和(IIIB)中，在苯環(huán)上取代的Y的位置沒有特別的限定，優(yōu)選Y對(duì)于用-COOR27表示的基團(tuán)(形成內(nèi)酯環(huán)時(shí)對(duì)應(yīng)的羰基)結(jié)合在間位上。
在用上述通式(IA)和(IB)表示的化合物中，優(yōu)選R1和R2之一是氫原子，另一個(gè)是用式(A)表示的基團(tuán)。在用式(A)表示的基團(tuán)中，X1至X4，優(yōu)選X1和X2是2-吡啶基甲基。在用上述通式(IA)和(IB)表示的化合物中，優(yōu)選m是0，n是1，且X4是氫原子，此時(shí)，優(yōu)選X1和X2同時(shí)是2-吡啶基甲基。作為R5和R6，優(yōu)選氫原子，在成像的用途中，優(yōu)選R5和R6是乙?；蛞阴Ｑ趸谆?yōu)選R3和R4同時(shí)是氫原子或者同時(shí)是氯原子。R7優(yōu)選是氫原子。
在用上述通式(II)表示的化合物中，優(yōu)選R13和R14同時(shí)是氫原子或者同時(shí)是氯原子。R17和R18是氫原子。
在用上述通式(IIIA)和(IIIB)表示的化合物中，優(yōu)選R21和R22之一是氫原子，另一個(gè)是用式(B)表示的基團(tuán)。在用式(B)表示的基團(tuán)中，X11至X14，優(yōu)選X11和X12是2-吡啶基甲基。在用上述通式(IIIA)和(IIIB)表示的化合物中，優(yōu)選p是0，q是1，且X14是氫原子，此時(shí)，優(yōu)選X11和X12同時(shí)是2-吡啶基甲基。優(yōu)選R23和R24同時(shí)是氫原子或者同時(shí)是氯原子。作為R25和R26，優(yōu)選氫原子，另外在成像的用途中，優(yōu)選R25和R26是乙酰基或乙酰氧基甲基。R27優(yōu)選是氫原子。
用上述通式(I)至(III)表示的本發(fā)明的化合物可以作為酸加成鹽或者堿加成鹽存在。作為酸加成鹽，例如可以列舉出鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽等無(wú)機(jī)酸鹽，或者甲磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、草酸、檸檬酸、酒石酸等有機(jī)酸鹽，作為堿加成鹽，可以列舉出鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等金屬鹽、銨鹽或者三乙胺鹽等有機(jī)胺鹽。除這些之外，有時(shí)也形成和甘氨酸等氨基酸的鹽。本發(fā)明的化合物或其鹽也有作為水合物或溶劑化物存在的情況，這些物質(zhì)都包含在本發(fā)明的范圍中。
用上述通式(IA)、(IB)、(II)、(IIIA)和(IIIB)表示的本發(fā)明的化合物根據(jù)取代基的種類，有具有1個(gè)或2個(gè)以上不對(duì)稱碳原子的情況，不僅基于1個(gè)或2個(gè)以上不對(duì)稱碳原子的光學(xué)活性體或基于2個(gè)以上不對(duì)稱碳原子的非對(duì)映異構(gòu)體等的立體異構(gòu)體、并且立體異構(gòu)體的任意混合物、外消旋體等都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，R7、R17或者R27是氫原子時(shí)，也有羧基形成內(nèi)酯的情況，本發(fā)明的范圍中也包含這樣結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體。另外，通式(IA)中的R5是氫原子的化合物和通式(IB)中的R7是氫原子的化合物相當(dāng)于互變異構(gòu)體，通式(IIIA)中的R25是氫原子的化合物和通式(IIIB)中的R27是氫原子的化合物相當(dāng)于互變異構(gòu)體。這樣的互變異構(gòu)體的存在容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，應(yīng)該理解為本發(fā)明的范圍包含任意一種互變異構(gòu)體。
本發(fā)明化合物的代表性化合物的制造方法顯示在下述的方案中。另外，在本說(shuō)明書的實(shí)施例中，更詳細(xì)且具體地顯示了記載在該方案中的制造方法。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些說(shuō)明，適當(dāng)選擇反應(yīng)原料、反應(yīng)條件和反應(yīng)試劑等，根據(jù)需要，通過對(duì)這些方法進(jìn)行修改或改變，全都可以制造上述通式表示的本發(fā)明的化合物。另外，可以按照例如龜谷哲治著，有機(jī)合成化學(xué)IX，南江堂，215頁(yè)(1977年)，制造可作為原料化合物使用的4-氨基熒光素、5-氨基熒光素和6-氨基熒光素。
例如可以通過下述方案的方法，使用作為反應(yīng)試劑和反應(yīng)原料的市售化合物等來(lái)制造通式(III)的化合物。

用上述通式(I)、通式(II)和通式(III)表示的本發(fā)明的化合物(具有氨基保護(hù)基的化合物除外)或其鹽作為鋅熒光探針是有用的。用上述通式(I)、通式(II)或通式(III)表示的本發(fā)明的化合物或其鹽其自體不具有發(fā)出強(qiáng)的熒光的性質(zhì)，但捕集鋅離子而形成鋅絡(luò)合物時(shí)，則能夠發(fā)出強(qiáng)的熒光。上述化合物或其鹽具有可以特異性捕集鋅離子且極其快速形成絡(luò)合物這樣的特征。形成的鋅絡(luò)合物還具有通過在生物體組織和細(xì)胞中不產(chǎn)生障礙的長(zhǎng)波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光而發(fā)出強(qiáng)的熒光這樣的特征。因而，用上述通式(I)、通式(II)或通式(III)表示的本發(fā)明的化合物或其鹽作為在生理?xiàng)l件下測(cè)定生物細(xì)胞和生物組織中的鋅離子濃度的鋅熒光探針是極其有用的。另外，本說(shuō)明書中使用的所謂“測(cè)定”術(shù)語(yǔ)包含定量和定性測(cè)定，應(yīng)該作最廣義的解釋。
本發(fā)明的鋅熒光探針的使用方法沒有特別的限定，可以和以往公知的鋅探針同樣使用。通常，將選自用上述通式(I)表示的化合物及其鹽的物質(zhì)溶解在生理鹽水或緩沖液等水性介質(zhì)或者乙醇、丙酮、乙二醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺等水混合性有機(jī)溶劑和水性介質(zhì)的混合物等中，將該溶液添加到含有細(xì)胞和組織的適當(dāng)?shù)木彌_液中，只要測(cè)定熒光光譜就可以。
例如，對(duì)于上述方案中的化合物6和化合物12的鋅絡(luò)合物，激發(fā)波長(zhǎng)分別是491nm和492nm，熒光波長(zhǎng)分別是513nm和514nm，在約1-10μm的濃度下使用時(shí)，可以測(cè)定10μM以下濃度的鋅離子。另外，將本發(fā)明的鋅熒光探針和適當(dāng)?shù)奶砑觿┙M合，以組合物的形式使用也可以。例如，可以和緩沖液、溶解助劑、pH調(diào)節(jié)劑等添加劑組合。
另外，例如化合物22具有大致可以容易透過細(xì)胞膜的脂溶性，透過細(xì)胞膜后，通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在的酯酶，得到水解的化合物12?；衔?2由于其水溶性，透過細(xì)胞膜困難，可以在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間停留。因而，化合物22對(duì)于測(cè)定存在于各個(gè)細(xì)胞內(nèi)的鋅離子是極其有用的。
實(shí)施例下面通過實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限定。實(shí)施例中化合物的號(hào)碼對(duì)應(yīng)于上述方案中的化合物號(hào)碼。
例1化合物6的合成將5.2g(16mmol)碳酸銫加到在50ml二甲基甲酰胺中溶解了2.5mg(7.2mmol)4-氨基熒光素(1)的溶液中。接著，往該溶液中添加3.1ml(15mmol)新戊酸酐，在室溫下攪拌1小時(shí)。用桐山漏斗過濾反應(yīng)液，減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺后，用硅膠柱精制，得到化合物2(3.6g)。白色固體。收率97％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)7.19(m，1H)，7.02(d，2H，J＝2.4)，6.93-6.94(m，2H)，6.88(d，2H，J＝8.7)，6.77(dd，2H，J＝8.7，2.4)，4.06(br，2H)，1.34(s，18H)MS(FAB)516(M++1)m.p.206-208℃(用甲醇重結(jié)晶)將化合物2(1.0g，2.0mmol)溶解在15ml吡啶中，添加1.2g(5.3mmol)4-硝基苯磺酰基氯后，在室溫下攪拌6小時(shí)。減壓下蒸餾除去吡啶，將殘?jiān)芙庠?5ml醋酸乙酯中。用2N鹽酸、飽和食鹽水洗滌該醋酸乙酯溶液后，用硫酸鈉干燥。在減壓下蒸餾除去醋酸乙酯后，通過硅膠柱精制，得到化合物3(1.2g)。白色固體。收率88％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.33(d，2H，J＝9.0)，8.05(d，2H，J＝9.0)，7.69(d，1H，J＝2.2)，7.45(dd，1H，J＝8.2，2.2)，7.07(d，1H，J＝8.2)，7.06-7.04(m，2H)，6.77-6.74(m，4H)，1.36(s，18H)MS(FAB)701(M++1)m.p.245-247℃(用醋酸乙酯+正己烷重結(jié)晶)將0.48g(1.5mmol)碳酸銫、1.3ml(14mmol)1，2-二溴乙烷加到在25ml二甲基甲酰胺中溶解了化合物3(0.97g，1.4mmol)的溶液中，在60℃下攪拌20小時(shí)。減壓下蒸餾除去二甲基甲酰胺，溶解到50ml醋酸乙酯中。用水、飽和食鹽水洗滌該醋酸乙酯溶液后，用硫酸鈉干燥。在減壓下蒸餾除去醋酸乙酯后，通過硅膠柱精制，得到化合物4(0.78g)。白色固體。收率70％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.38(d，2H，J＝9.0)，7.86(d，2H，J＝9.0)，7.76(d，1H，J＝2.0)，7.45(dd，1H，J＝8.0，2.0)，7.17(d，1H，J＝8.0)，7.08(m，2H)，6.85-6.84(m，4H)，4.01(t，2H，J＝6.8)，3.45(t，2H，J＝6.8)，1.37(s，18H)MS(FAB)807，809(M++1)m.p.280-281℃(用乙腈重結(jié)晶)將化合物4(0.10g，0.13mmol)懸浮在4ml乙腈中，添加55mg(0.33mmol)碘化鉀、43mg(0.31mmol)碳酸鉀、78mg(0.39mmol)2，2’-二皮考基胺，回流14小時(shí)。在減壓下蒸餾除去乙腈后，溶解在2N碳酸鈉水溶液中，用二氯甲烷萃取。用飽和食鹽水洗滌二氯甲烷層后，用硫酸鈉干燥。在減壓下蒸餾除去二氯甲烷，通過硅膠柱精制，得到化合物5(80mg)。淡黃色油。收率69％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.47-8.45(m，2H)，8.32(d，2H，J＝9.0)，7.77(d，2H，J＝9.0)，7.69-7.61(m，3H)，7.61(d，2H，J＝7.9)，7.27-7.23(m，1H)，7.14(m，2H)，7.07(d，2H，J＝2.2)，6.99(d，1H，J＝8.0)，6.82(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.72(d，2H，J＝8.6)，3.82(s，4H)，3.82(m，2H)，2.72(t，2H，J＝6.4)，1.37(s，18H)MS(FAB)926(M++1)將26mg(0.19mmol)碳酸鉀、12μl(0.12mmol)苯硫酚添加到在4ml二甲基甲酰胺中溶解了化合物5(34mg，37μmol)的溶液中，在室溫下攪拌3小時(shí)。將在1ml甲醇和1ml水中溶解了70mg(1.2mmol)氫氧化鉀的溶液加到反應(yīng)混合物中，在室溫下攪拌20小時(shí)。將2ml、2N鹽酸加到該混合物中后，在減壓下蒸餾除去溶劑。在10ml乙醇中懸浮并過濾后，在減壓下蒸餾除去乙醇。用逆相色譜HPLC精制殘?jiān)?，得到化合?(15mg)。褐色固體。收率70％。1H-NMR(CD30D，300MHz)8.61-8.59(m，2H)，8.04-7.98(m，2H)，7.63(d，2H，J＝7.9)，7.51-7.46(m，2H)，7.14(d，1H，J＝2.0)，7.02(d，2H，J＝9.0)，6.95-6.87(m，4H)，6.79(dd，2H，J＝9.0，2.4)，4.46(s，4H)，3.50(t，2H，J＝6.0)，3.25(m，2H)MS(FAB)573(M++1)例2化合物12的合成和化合物2的合成法一樣，由3.5g(10mmol)5-氨基熒光素(7)，得到化合物8(4.4g)。白色固體。收率84％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)7.77(d，1H，J＝7.9)，7.01(d，2H，J＝2.0)，6.95(d，2H，J＝8.6)，6.80-6.75(m，3H)，6.22(d，1H，J＝1.7)，4.21(br，2H)，1.36(s，18H)MS(FAB)516(M++1)m.p.161-163℃(用甲醇重結(jié)晶)和化合物3的合成法一樣，由化合物8(3.6g，6.9mmol)得到化合物9(4.1g)。白色固體。收率84％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.61(br，1H)，8.20(d，2H，J＝9.0)，7.88(d，1H，J＝8.3)，7.81(d，2H，J＝9.0)，7.33-7.29(m，1H)，7.05(d，2H，J＝2.2)，6.84(d，1H，J＝1.8)，6.74(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.69(d，2H，J＝8.6)，1.38(s，18H)MS(FAB)701(M++1)m.p.189-191℃(用醋酸乙酯+正己烷重結(jié)晶)和化合物4的合成法一樣，由化合物9(0.51g，0.73mmol)得到化合物10(0.35g)。白色固體。收率60％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.11(d，2H，J＝9.0)，8.10-8.09(m，1H)，7.71(dd，1H，J＝8.2，1.8)，7.56(d，2H，J＝9.0)，7.02(d，2H，J＝2.2)，6.86(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.79(d，2H，J＝8.6)，6.43(d，1H，J＝1.8)，3.85(t，2H，J＝6.6)，3.40(t，2H，J＝6.6)，1.38(s，18H)MS(FAB)807，809(M++1)m.p.268-269℃(用乙腈重結(jié)晶)和化合物5的合成法一樣，由化合物10(0.31g，0.38mmol)，得到化合物11(0.27g)。淡黃色固體。收率75％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.45-8.42(m，2H)，8.06(d，2H，J＝9.0)，7.96(d，1H，J＝8.3)，7.64-7.59(m，2H)，7.52(d，2H，J＝9.0)，7.53-7.50(m，1H)，7.33(d，2H，J＝7.7)，7.17(m，2H)，7.00(d，2H，J＝2.2)，6.78(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.64(d，2H，J＝8.6)，6.48(d，1H，J＝1.3)，3.71(s，4H)，3.67(t，2H，J＝6.2)，2.67(t，2H，J＝6.2)，1.37(s，18H)MS(FAB)926(M++1)m.p.146-148℃(用甲醇重結(jié)晶)和化合物6的合成法一樣，由化合物11(20mg，22μmol)，得到化合物12(6.6mg)。褐色固體。收率53％。1H-NMR(CD3OD，300MHz)8.44-8.42(m，2H)，7.94-7.88(m，2H)，7.60(d，1H，J＝8.4)，7.49(d，2H，J＝7.9)，7.45-7.41(m，2H)，6.71(br，1H)，6.65(d，2H，J＝2.4)，6.61(d，2H，J＝8.8)，6.51(dd，2H，J＝8.8，2.4)，6.02(d，1H，J＝1.8)，4.30(s，4H)，3.28(t，2H，J＝6.0)，3.03(t，2H，J＝6.0)MS(FAB)573(M++1)
例3化合物15的合成將16g(84mmol)4-硝基酞酸酐(13)和24g(0.17mol)4-氯間苯二酚溶解在250ml甲磺酸中，在氬氣下，在80℃攪拌60小時(shí)。冷卻至室溫后，一點(diǎn)一點(diǎn)地添加至冰水1.4L。濾取析出的固體，得到37g化合物15。收率定量。
化合物16的合成將20g(45mmol)化合物(15)懸浮在700ml水中，添加54g(0.23mol)硫化鈉9水合物和20g(0.25mol)硫氫化鈉n水合物(硫氫化鈉約70％)。在氬氣下，回流20小時(shí)。冷卻至室溫后，添加鹽酸，使pH為3-4。濾取析出的固體，得到19g化合物(16)。收率定量。
化合物17的合成和化合物(2)的合成法一樣，由4.4g(11mmol)化合物(16)，得到3.9g化合物(17)。收率62％。
MS(FAB)584，586，588(M++1)化合物18及18’的合成和化合物(3)的合成法一樣，由3.8g(6.5mmol)化合物(17)，得到1.9g化合物(18)，1.8g化合物(18’)。收率化合物(18)38％，化合物(18’)35％。
化合物(18)1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.38(d，2H，J＝8.7)，8.07(d，2H，J＝8.7)，7.72(d，1H，J＝2.1)，7.48(dd，1H，J＝8.1，2.1)，7.12(d，1H，J＝8.1)，7.11(s，2H)，6.77(s，2H)，1.40(s，18H)MS(FAB)769，771，773(M++1)化合物(18’)1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.26(d，2H，J＝8.6)，7.93(d，1H，J＝8.4)，7.84(d，2H，J＝8.6)，7.27(dd，1H，J＝8.4，2.0)，7.13(s，2H)，6.99(d，1H，J＝2.0)，6.75(s，2H)，1.42(s，18H)MS(FAB)769，771，773(M++1)化合物19的合成和化合物(4)的合成法一樣，由1.5g(2.0mmol)化合物(18)，得到1.2g化合物(19)。收率66％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.39(d，2H，J＝9.0)，7.85(d，2H，J＝9.0)，7.79(d，1H，J＝2.0)，7.51(dd，1H，J＝8.2，2.0)，7.18(d，1H，J＝8.2)，7.14(s，2H)，6.89(s，2H)，4.06(t，2H，J＝6.8)，3.50(t，2H，J＝6.8)，1.40(s，18H)MS(FAB)875，877，879，881(M++1)化合物19’的合成和化合物(4)的合成法一樣，由1.5g(2.0mmol)化合物(18’)，得到0.70g化合物(19’)。收率40％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.19(d，2H，J＝9.0)，8.13(d，1H，J＝8.3)，7.70(brd，1H)，7.62(d，2H，J＝9.0)，7.11(s，2H)，6.84(s，2H)，6.63(d，1H，J＝1.8)，3.94(t，2H，J＝6.4)，3.46(t，2H，J＝6.4)，1.41(s，18H)MS(FAB)875，877，879，881(M++1)化合物20的合成和化合物(5)的合成法一樣，由1.0g(1.1mmol)化合物(19)，得到0.56g化合物(20)。收率49％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.50-8.47(m，2H)，8.33(d，2H，J＝8.7)，7.76(d，2H，J＝8.7)，7.70-7.60(m，3H)，7.46(d，2H，J＝7.9)，7.32(brd，1H，J＝8.3)，7.16-7.12(m，2H)，7.14(s，2H)，7.00(d，1H，J＝8.3)，6.79(s，2H)，3.87(t，2H，J＝6.0)，3.83(s，4H)，2.76(t，2H，J＝6.0)，1.41(s，18H)MS(FAB)994，996，998(M++1)化合物20’的合成和化合物(5)的合成法一樣，由0.20g(0.23mmol)化合物(19’)，得到75mg化合物(20’)。收率33％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.43-8.41(m，2H)，8.17(d，2H，J＝9.0)，7.97(d，1H，J＝8.3)，7.63-7.57(m，2H)，7.56(d，2H，J＝9.0)，7.49(brd，1H，J＝8.3)，7.31(d，2H，J＝7.7)，7.16-7.12(m，2H)，7.08(s，2H)，6.79(s，2H)，6.72(d，2H，J＝1.1)，3.74(t，2H，J＝6.2)，3.71(s，4H)，2.74(t，2H，J＝6.2)，1.40(s，18H)MS(FAB)994，996，998(M++1)化合物21的合成和化合物(6)的合成法一樣，由0.26g(0.26mmol)化合物(20)，得到98mg化合物(21)。收率35％。1H-NMR(CD3OD，300MHz)8.56(brd，2H，J＝4.8)，7.98-7.91(m，2H)，7.57(d，2H，J＝7.9)，7.46-7.41(m，2H)，6.94-6.81(m，3H)，6.73(s，2H)，6.56(s，2H)，4.48(s，4H)，3.50(t，2H，J＝5.5)，3.29(t，2H，J＝5.5)MS(FAB)641，643，645(M++1)化合物21’的合成和化合物(6)的合成法一樣，由0.20g(0.20mmol)化合物(20’)，得到58mg化合物(21’)。收率26％。1H-NMR(CD30D，300MHz)8.45-8.43(m，2H)，7.93-7.88(m，2H)，7.58(d，1H，J＝8.6)，7.50(d，2H，J＝7.9)，7.45-7.41(m，2H)，6.72(s，2H)，6.73-6.88(m，1H)，6.58(s，2H)，6.01(d，1H，J＝1.8)，4.30(s，4H)，3.27(t，2H，J＝5.7)，3.06(t，2H，J＝5.7)MS(FAB)641，643，645(M++1)化合物22的合成將140mg(0.13mmol)化合物(12)懸浮在10ml乙腈中，添加0.19g(0.30mmol)碳酸銫后，一點(diǎn)一點(diǎn)添加28μl醋酸酐。在室溫下攪拌1小時(shí)后，過濾反應(yīng)液。在減壓下蒸餾除去溶劑后，用硅膠柱精制，得到79mg化合物(22)。收率94％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.51-8.49(m，2H)，7.73(d，1H，J＝8.4)，7.60-7.54(m，2H)，7.31(d，2H，J＝7.7)，7.15-7.11(m，2H)，7.05(d，2H，J＝2.2)，6.96(d，2H，J＝8.6)，6.80(dd，2H，J＝2.2，8.6)，6.77-6.74(m，1H)，6.48(br，1H)，6.02(d，1H，J＝1.7)，3.86(s，4H)，3.06(br，2H)，2.82(t，2H，J＝5.1)，2.31(s，6H)例4使用在上述例1中得到的化合物6和例2中得到的化合物12，評(píng)價(jià)對(duì)于鋅離子的選擇性。將5μM化合物6或化合物12加到100mM含有各種金屬離子(5μM或5mM)的HEPES緩沖液(pH7.5)中，對(duì)于化合物6，在激發(fā)波長(zhǎng)491nm，熒光波長(zhǎng)513nm，對(duì)于化合物12，在激發(fā)波長(zhǎng)492nm，熒光波長(zhǎng)514nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖1(化合物6)和圖2(化合物12)。另外，將1μM化合物21加到100mM含有各種金屬離子(1μM或5mM)的HEPES緩沖液(pH7.5)中，在激發(fā)波長(zhǎng)505nm，熒光波長(zhǎng)522nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖3中。
圖中，對(duì)于縱軸的熒光強(qiáng)度，將不添加金屬離子時(shí)的熒光強(qiáng)度設(shè)為1，用數(shù)值表示添加各金屬離子時(shí)的熒光強(qiáng)度。本發(fā)明的化合物6和化合物12對(duì)于鋅離子具有極高的選擇性，即使在生物體內(nèi)大量存在的鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子以高濃度(5mM)存在的條件下，熒光強(qiáng)度也完全沒有增加。另外，也可以看出這些金屬離子不對(duì)由鋅離子的熒光強(qiáng)度增大產(chǎn)生影響。
化合物21顯示出對(duì)鋅高的選擇性。特別是，在生物體內(nèi)大量存在的金屬離子鈉、鉀、鈣、鎂即使在5mM的高濃度下添加，熒光強(qiáng)度也幾乎沒有增大。另外，這些金屬離子不對(duì)由鋅的熒光強(qiáng)度增大產(chǎn)生影響。
例5將鋅離子(最終濃度5μM，50μM)加到100mM含有5μM化合物6、化合物12或ACF-1(特愿平11-40325號(hào)的實(shí)施例1中作為化合物(20)記載的具有環(huán)狀聚胺部分的化合物)的HEPES(pH7.5)中，測(cè)定熒光強(qiáng)度。對(duì)于化合物6，在激發(fā)波長(zhǎng)491nm，熒光波長(zhǎng)513nm，對(duì)于化合物12，在激發(fā)波長(zhǎng)492nm，熒光波長(zhǎng)514nm，對(duì)于ACF-1，在激發(fā)波長(zhǎng)495nm，熒光波長(zhǎng)515nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖4中。圖中，縱軸表示相對(duì)熒光強(qiáng)度。從該結(jié)果可以看出，對(duì)于ACF-1，熒光強(qiáng)度沒有瞬時(shí)增大，而對(duì)于本發(fā)明的化合物6和化合物12，熒光強(qiáng)度瞬時(shí)增大了。因而，使用本發(fā)明的化合物時(shí)，可以在極短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出鋅，也可以檢測(cè)出鋅的快速濃度變化。 例6測(cè)定將各種濃度的鋅離子加到100mM含有5μM化合物6、化合物12、ACF-1或者Newport Green(Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals，第6版，Richard P.Haugland，pp.531-540)的HEPES緩沖液(pH7.5)時(shí)的熒光強(qiáng)度的變化。對(duì)于化合物6，在激發(fā)波長(zhǎng)491nm，熒光波長(zhǎng)513nm，對(duì)于化合物12，在激發(fā)波長(zhǎng)492nm，熒光波長(zhǎng)514nm，對(duì)于ACF-1，在激發(fā)波長(zhǎng)495nm，熒光波長(zhǎng)515nm，對(duì)于Newport Green，在激發(fā)波長(zhǎng)505nm，熒光波長(zhǎng)530nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖5中。圖中，對(duì)于縱軸的熒光強(qiáng)度，將不添加金屬離子時(shí)的熒光強(qiáng)度設(shè)為1，用數(shù)值表示添加各濃度的鋅離子時(shí)的熒光強(qiáng)度。本發(fā)明的化合物6和化合物12顯示出高的測(cè)定靈敏度。特別是，證明了化合物12的測(cè)定靈敏度非常高，螯合部分和發(fā)熒光部分的組合是最佳的。
例7研究了化合物12以及化合物21和這些化合物的鋅絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度變化對(duì)于pH的變化。對(duì)于化合物12，在激發(fā)波長(zhǎng)492nm，熒光波長(zhǎng)514nm，對(duì)于化合物21，在激發(fā)波長(zhǎng)505nm，熒光波長(zhǎng)522nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖6中。
使用以下的緩沖液100mM Cl2CHCOOH-Cl2CHCOONa緩沖液(pH2.0)100mM ClCH2COOH-ClCH2COONa緩沖液(pH3.0)100mM AcOH-AcONa緩沖液(pH4.0，4.5，5.0)100mM MES緩沖液(pH5.5，6.0，6.5)100mM HEPES緩沖液(pH7.0，7.5，8.0)100mM CHES緩沖液(pH8.5)和化合物12比較，可以看出化合物21在細(xì)胞內(nèi)的pH為7.4附近熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，是難于受到細(xì)胞內(nèi)pH變化影響的探針。
例8使用大鼠的海馬切片來(lái)研究由缺血刺激產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的變化。
將10μM化合物22加到大鼠的海馬切片中，培養(yǎng)后，進(jìn)行10分鐘(圖中2分-12分)缺血刺激，并看到熒光像的時(shí)間變化。結(jié)果示于圖7中。
海馬切片的制作使用如下組成的林格氏液。
(1)林格氏液組成124mM NaCl、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、2mMCaCl2、26mM NaHCO3、1mM MgCl2、10mM葡萄糖(2)缺血用林格氏液組成124mM NaCl、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、2mMCaCl2、26mM NaHCO3、1mM MgCl2、10mM 2-脫氧葡萄糖(3)膽堿-林格氏液組成124mM膽堿、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、0.5mMCaCl2、26mM NaHCO3、2.5mM MgCl2、10mM葡萄糖用于切片的調(diào)制和測(cè)定的林格氏液通常通入95％O2/5％CO2氣體。
用乙醚將Wistar大鼠(200-250g，雄性)麻醉。斷頭后，迅速摘出全腦，將其放入冰冷的膽堿-林格氏液中，放置10分鐘。在涂滿冰冷的膽堿-林格氏液和呈果醬狀的膽堿-林格氏液的培養(yǎng)皿上劃分為左右半球，除去間腦，用刮勺取出海馬。將海馬放到瓊脂上，用別針固定，用旋轉(zhuǎn)刮刀切成300μm大小。將切片的海馬放入加熱到30℃的林格氏液中，放置30分鐘至1小時(shí)。在室溫下，將海馬放置在林格氏溶液中直至使用。
接著，用林格氏液將在10mM DMSO中溶解了化合物22的溶液稀釋至10μM。將海馬切片放入該溶液中，遮光，在室溫下培養(yǎng)1.5小時(shí)。移到另外的林格氏溶液中進(jìn)行替換，大約30分鐘至1小時(shí)30分鐘洗凈后，移到室中并進(jìn)行測(cè)定。在室內(nèi)循環(huán)通常將溫度加熱到33-34℃的林格氏液(流速2-3ml/分)。用倒立顯微鏡(奧林巴斯IX-70)進(jìn)行測(cè)定(物鏡4倍，二色性鏡505nm)。
缺血刺激根據(jù)以下要點(diǎn)通過交換在室內(nèi)循環(huán)的林格氏液進(jìn)行。
林格氏液(通入95％O2+5％CO2)2分(圖表中從01 00.00至02 00.00)→缺血用林格氏液(通入95％N2+5％CO2)10分(圖表中03 00.00至12 00.00)→林格氏液(通入95％O2+5％CO2)4分(圖表中由13 00.00至16 00.00)。
從該結(jié)果可以看出，在報(bào)導(dǎo)的通過缺血刺激引起細(xì)胞死亡的CA1區(qū)域，從缺陷刺激開始約3分鐘后，熒光強(qiáng)度增大。
而且，如圖8所示，缺血刺激后，在CA1區(qū)域(圖中1，2，3)熒光強(qiáng)度顯著增大。即使在CA3區(qū)域(圖中4)、齒狀回(圖中6，7)，熒光強(qiáng)度也增大。圖的縱軸以在測(cè)定開始時(shí)(0.00秒)的熒光強(qiáng)度為1.00來(lái)表示。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的化合物作為用作鋅測(cè)定的熒光探針是有用的。特別是，本發(fā)明的化合物具有在極短的時(shí)間內(nèi)可以形成和鋅的絡(luò)合物這樣的特征，由于測(cè)定敏感度極其高，所以作為正確測(cè)定在生物體內(nèi)的鋅離子的快速濃度變化的試劑是極其有用的。
權(quán)利要求
1.用下述通式(IA)或(IB)表示的化合物或其鹽 式中，R1和R2分別獨(dú)立地表示氫原子或者用下述式(A)表示的基團(tuán) 式中，X1、X2、X3和X4分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基、2-吡啶基甲基或者氨基的保護(hù)基，m和n分別獨(dú)立地表示0或1，R1和R2不能同時(shí)是氫原子；R3和R4分別獨(dú)立地表示氫原子或者鹵原子；R5和R6分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基，R7表示氫原子或者烷基。
2.用下述通式(II)表示的化合物或其鹽 式中，R13和R14分別獨(dú)立地表示氫原子或鹵原子；R17表示氫原子或烷基；R18表示氫原子或氨基的保護(hù)基。
3.權(quán)利要求2記載的化合物或其鹽，R17和R18是氫原子。
4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3記載的化合物或其鹽，R13和R14同時(shí)是氫原子或者R13和R14同時(shí)是氯原子。
5.用下述通式(IIIA)或(IIIB)表示的化合物或其鹽 式中，R21和R22分別獨(dú)立地表示氫原子或用下述式(B)表示的基團(tuán)， 式中，X11、X12、X13和X14分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基、2-吡啶基甲基或者氨基的保護(hù)基，p和q分別獨(dú)立地表示0或1，R21和R22不能同時(shí)是氫原子；Y表示-CO-NH-或-NH-CO-；R23和R24分別獨(dú)立地表示氫原子或鹵原子；R25和R26分別獨(dú)立地表示氫原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基；R27表示氫原子或烷基。
6.一種鋅熒光探針，含有權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)權(quán)利要求記載的化合物(但是引入氨基保護(hù)基的化合物除外)或它們的鹽。
7.一種鋅絡(luò)合物，由權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)權(quán)利要求記載的化合物(但是引入氨基保護(hù)基的化合物除外)或它們的鹽和鋅離子形成的。
8.一種鋅離子的測(cè)定方法，其特征在于將權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)權(quán)利要求記載的化合物(但是引入氨基保護(hù)基的化合物除外)或它們的鹽用作鋅熒光探針。
9.一種鋅離子的測(cè)定方法，其特征在于包括以下工序(a)使權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)權(quán)利要求記載的化合物(但是引入氨基保護(hù)基的化合物除外)或它們的鹽和鋅離子反應(yīng)的工序，以及(b)測(cè)定在上述工序中生成的鋅絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度的工序。
全文摘要
作為鋅熒光探針有用的用通式(IA)表示的化合物或其鹽，其中[R
文檔編號(hào)C09B11/28GK1407979SQ01805747
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月28日
發(fā)明者長(zhǎng)野哲雄, 菊地和也, 平野智也 申請(qǐng)人:第一化學(xué)藥品株式會(huì)社, 長(zhǎng)野哲雄