一種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明是關(guān)于一種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用。所述的嗜酸乳桿菌是一種嗜酸乳桿菌FZU?LA1301X，保藏號為：CGMCC No. 12453，保藏日期為2016年5月16日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。嗜酸乳桿菌FZU?LA1301X可以在斷奶仔豬體內(nèi)定植，對胃酸、膽鹽和腸液有較強的耐受性；在改進的發(fā)酵培養(yǎng)基中有較好的活菌數(shù)，噴霧干燥后有較高的存活率，可用于動物飼料添加劑。CGMCC No. 1245320160516
【專利說明】
-種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 目前普遍采用在飼料中添加抗生素藥物的辦法來預(yù)防動物腹瀉，但抗生素會破壞 消化道微生態(tài)平衡，還會導(dǎo)致免疫機能下降，并且容易在畜產(chǎn)品中殘留，對人類健康構(gòu)成極 大威脅。因此，無殘留、無毒副作用、無耐藥性的抗生素替代品一微生態(tài)制劑應(yīng)運而生。微生 物飼料添加劑具有維護動物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、調(diào)節(jié)機體代謝和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的 功能。在飼料工業(yè)中人們將微生態(tài)制劑作為抗生素最有效的替代產(chǎn)品之一，寄希望于通過 微生態(tài)制劑生產(chǎn)安全的畜產(chǎn)品，同時強化對環(huán)境的保護。
[0003] 1989年，美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料監(jiān)察協(xié)會(AAFC0)公布了可用于飼 喂的微生物;2008年，我國農(nóng)業(yè)部1126號公告中規(guī)定了 16種飼料微生物添加劑。主要有乳桿 菌屬、雙歧桿菌屬、芽抱桿菌屬、鏈球菌屬和酵母菌屬等。其中乳酸菌制劑作為飼料添加劑 應(yīng)用較多的有嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和糞鏈球菌，制成乳酸菌發(fā)酵飼料、乳酸菌粉和乳酸菌 提取物。
[0004] 在16種飼料級微生物添加劑中，嗜酸乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強動物免 疫力、提高生產(chǎn)性能等諸多功能，并且由于乳酸菌的產(chǎn)酸功能，還可W替代飼料中的酸化 劑，因此被認為是一種理想的微生態(tài)制劑。但嗜酸乳桿菌耐溫性不佳，活性下降快，產(chǎn)品中 活菌數(shù)很難達到規(guī)定的最小活菌限量106C化/g。因而選育耐高溫菌株具有極為重要的理論 意義和廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)合紫外誘變和高溫馴化后得到的嗜酸乳桿菌，使得 該嗜酸乳桿菌具有良好的耐溫性和耐消化能力。
[0006] 本發(fā)明提供的菌株是嗜酸乳桿菌(Zaciobaci^t/s acic/o如_z'Jt/Sy>FZU-LA1301X，保 藏號為:CGMCC No. 12453,保藏日期為2016年5月16日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中屯、，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研 究所。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下： 1、 通過紫外誘變篩選得到具有較強耐消化能力的嗜酸乳桿菌； 2、 對耐消化菌株通過高溫馴化得到耐溫性良好的嗜酸乳桿菌； (1)人工胃液的配制 用Imol/L的肥1將MRS液體培養(yǎng)基的抑值調(diào)至3.0-5.0，121°C滅菌20min，無菌添加胃 蛋白酶3-10 mg/mL，化C1 0.3%-0.9%，配制模擬胃液。置于合適的溫度中培養(yǎng)，通過平板計 數(shù)法計算活菌數(shù)。
[000引（2)不同膽鹽濃度的配制 在MRS液體培養(yǎng)基中加入豬膽鹽，使其濃度分別為0%-0.6%。將活化后的乳酸菌菌株按 1% - 5%的接種量接種于上述不同濃度的液體培養(yǎng)基中，再置于合適的溫度中培養(yǎng)，通過平 板計數(shù)法計算活菌數(shù)。
[0009] (3)人工腸液的配制 用Imol/L的化0H將MRS液體培養(yǎng)基pH值調(diào)至6.0-8.0，121°C滅菌20min，無菌添加膜酶 3-lOmg/mL，豬膽鹽0.03%-0.3%，化C1 0.3%-0.9%，配制模擬腸液。置于合適的溫度中培 養(yǎng)，通過平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。
[0010] 3、本發(fā)明所述的在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加薦糖、乳糖和麥芽糖作為碳源;不 同濃度的蛋白腺、膜蛋白腺和大豆蛋白腺為氮源;3%~5%濃度的黃瓜汁、西紅柿汁和胡蘿h 汁為增殖因子;分別調(diào)節(jié)接種量至1%~5%、初始pH值5.8~6.2和取樣時間，嗜酸乳桿菌在優(yōu) 化后的培養(yǎng)基中有較高的活菌量，達5.0Xl〇8 C化/mL~5.0X109 C化/mL。
[0011] 4、采用噴霧干燥技術(shù)制備乳酸菌制劑，W阿拉伯膠、麥芽糊精、可溶性淀粉為噴霧 干燥的壁材，分別在10-30%的濃度下進行噴霧干燥，測定菌粉中的活菌數(shù)。嗜酸乳桿菌在噴 霧干燥后有較高的活菌數(shù)5.0Xl〇8 C化/g~5.0X109 cfu/g，可用于動物的飼料添加劑。
[0012] 5、前述的嗜酸乳桿菌的應(yīng)用，其中所述的嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X用于動物的飼 料添加劑進行斷奶仔豬的飼喂，結(jié)果是能有效的促進斷奶仔豬的生長，明顯提高仔豬的生 長性能，且將降低腹瀉率和死亡率降至5%之內(nèi)。菌劑在仔豬飼料中的添加量為50-300g/t。
[0013] 借由上述的技術(shù)方案，本發(fā)明通過紫外誘變和高溫馴化得到一株耐消化能力和耐 溫性良好的嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X，該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中有較高的活菌數(shù)，噴霧干燥后 有較高的活菌數(shù)，且乳酸菌制劑具有促進仔豬生長和降低腹瀉率、死亡率的能力。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發(fā)明嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X的光學(xué)顯微鏡圖。
[0015] 圖2為馴化前后菌株的生長曲線圖。
[0016] 圖3為微膠囊膽藏穩(wěn)定性圖。
【具體實施方式】 [0017]實施例1: 嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X的誘變馴化 將MRS發(fā)酵液于4000r/m離屯、15min，重懸于生理鹽水中，調(diào)整菌體濃度為108c化/mL，f|jU 成細胞懸浮液。將菌懸液在最佳的誘變時間(致死率在70%-80%)照射后，稀釋適合的倍數(shù)后 涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，置于37°C中培養(yǎng)2地，W耐消化能力為篩選指標，選取最佳的突變 菌株嗜酸乳桿菌FZU-LA1301Y。
[0018] 將紫外誘變得到的突變株接種于MRS液體培養(yǎng)基中37Γ培養(yǎng)至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)移 至42Γ環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)2地，再轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基，同時平板計數(shù)其存活率。在42Γ中反 復(fù)傳代5代，使其連續(xù)2-3代的存活率達90%W上，再將培養(yǎng)溫度提高至45Γ，篩選連續(xù)2-3代 的存活率達90%W上的菌株，再繼續(xù)提高馴化溫度。最終得到能耐46°C的嗜酸乳桿菌FZU- LA1301X。
[0019] 獲得的嗜酸乳桿菌保藏號為:CGMCC No. 12453,保藏日期為2016年5月16日，保藏 單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、。
[0020] 如附圖1所示，嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X菌落形態(tài)呈白色、圓形，邊緣完整，表面光 滑。在光學(xué)顯微鏡下細胞形狀為桿狀，革蘭氏染色呈陽性。
[0021] 實施例2: 嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X耐消化能力實驗 1、相關(guān)配方 (4)人工胃液的配制 用Imol/L的肥1將MRS液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)至3.0、3.5、4.0、4.5，12rC滅菌20min，無菌 添加胃蛋白酶5mg/mL，化C1 0.5%，配制模擬胃液。置于合適的溫度中培養(yǎng)，通過平板計數(shù)法 計算活菌數(shù)。
[0022] 巧)不同膽鹽濃度的配制 在MRS液體培養(yǎng)基中加入豬膽鹽，使其濃度分別為0%(對照）、0.15%、0.3%。將活化后的 乳酸菌菌株按1%的接種量接種于上述不同濃度的液體培養(yǎng)基中，再置于合適的溫度中培 養(yǎng)，通過平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。
[0023] (6)人工腸液的配制 用Imol/L的化0聞尋MRS液體培養(yǎng)基pH值調(diào)至6.0、7.0、8.0，12TC滅菌20min，無菌添加 膜酶5mg/mL，豬膽鹽0.3%，化C1 0.5%，配制模擬腸液。置于合適的溫度中培養(yǎng)，通過平板計 數(shù)法計算活菌數(shù)。
[0024] 2、實驗結(jié)果 表1 FZU-LA1301X在模擬胃液下的菌數(shù)Log(C即/血）
表3 FZU-LA1301X在模擬胃液下的菌數(shù)Log(C即/血）
在1%的接種量下，嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X對胃酸、膽鹽和腸液都有很好的耐受性，在 胃酸環(huán)境中化后，活菌數(shù)活菌數(shù)是上升的，說明該菌株能順利通過胃環(huán)境且保持一定的活 菌數(shù)到達腸道;0%-0.3%的膽鹽濃度對嗜酸乳桿菌無抑制作用，相較于化，24h時的活菌數(shù) 在增加;同樣，腸液環(huán)境對活菌數(shù)影響不大，說明該菌株能耐受腸液環(huán)境且在腸道中存活。
[0025] 實施例3:乳酸菌制劑的制備 1、采用噴霧干燥技術(shù)制備乳酸菌制劑，W阿拉伯膠為噴霧干燥的壁材，設(shè)置進口溫度 160°C、壁材濃度20%，進料速率400mL/h和壁材比例1:9，噴霧后活菌數(shù)為8.70 log CFU/g。
[0026] 2、測定乳酸菌制劑的包埋率和穩(wěn)定性 微膠囊的包埋率是評價微膠囊質(zhì)量的重要指標之一，是指微膠囊中的活菌數(shù)與產(chǎn)品中 的活菌數(shù)的比值。乳酸菌制劑包埋率為72.18%。
[0027] 穩(wěn)定性是含活菌制劑微膠囊質(zhì)量評價中的重要指標，為評價微膠囊的貨架穩(wěn)定 性，將噴霧后的微膠囊分別置于常溫(約25Γ)和4Γ條件下膽藏，并定期測定其活菌數(shù)，結(jié) 果如圖3所示。無論是在4°C還是常溫保存，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)都呈下降趨勢，但在4°C膽 藏時下降比較緩慢，第3天到第45天，活菌數(shù)從7.89 log CRJ/g下降至7.0 log CFU/g，第90 天時活菌數(shù)為6.23 log CFU/g;而常溫膽藏下降一個數(shù)量級大約10-15天，第30天時活菌數(shù) 為6.08 1ogCFU/g。
[0028] 實施例4:乳酸菌菌劑的應(yīng)用 1、實驗方法 1.1斷奶仔豬生長性能測定 實驗共分4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)50頭斷奶仔豬。其中，W不添加任何添加劑為對 照組，W噴霧干燥后的乳酸菌菌粉為實驗組，試驗期30天。飼喂方法見表4。
[00巧]表4飼喂試驗分組
斷奶仔豬生長性能測定主要包括W下指標:平均日增重、平均日采食量、料重比、腹瀉 率和死亡率。
[0030] 平均日增重測定:每天對斷奶仔豬進行空腹稱重，并記錄當天每頭仔豬的初重和 末重，計算平均日增重。
[0031] 平均日采食量測定:記錄各組每天飼料實際消耗量，計算平均日采食量。
[0032] 料重比（即飼料轉(zhuǎn)化率)計算:平均日采食量/平均日增重。
[0033] 腹瀉率:每天觀察斷奶仔豬的腹瀉情況，及時記錄腹瀉個體，并按腹瀉率（％ )=實 驗期內(nèi)某組腹瀉總次數(shù)/(實驗期內(nèi)某組豬總頭數(shù)X飼養(yǎng)天數(shù))方法來計算腹瀉率。
[0034] 死亡率:記錄類似于腹瀉率，按死亡率（％ )=實驗期內(nèi)某組死亡頭數(shù)/實驗期內(nèi)某 組豬總頭數(shù)計算死亡率。
[0035] 1.2斷奶仔豬糞便樣品微生物 試驗結(jié)束時，各組隨機采集新鮮糞便樣品，用選擇性培養(yǎng)基測定其中的乳酸菌及大腸 桿菌的活菌數(shù)變化情況，并記錄。
[0036] 2、實驗結(jié)果 各實驗組對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉的防治效果的影響見表5。實驗前仔豬的初始重 無顯著差異，符合實驗要求；在均日增重方面，乳酸菌組較于對照組，有顯著性差異（P< 0.05);腹瀉率方面，與對照組相比，乳酸菌組腹瀉率下降了 57.55%;死亡率方面，與對照組 相比，乳酸菌組死亡率下降了40.03%，可見在飼料中添加乳酸菌能防治仔豬腹瀉，降低斷奶 仔豬的死亡率。
[0037] 表5乳酸菌制劑對斷奶仔豬生長性能的影響
注：同行肩標小寫字母或無字母表示差異不顯著(P〉〇.05)，小寫字母不同表示差異顯 著（P<0.05) 乳酸菌、地衣芽抱桿菌和酵母對斷奶仔豬糞便微生物菌群的影響如表6所示。與對照組 相比，實驗組的仔豬糞便中乳酸菌數(shù)量顯著高于對照組，而大腸桿菌數(shù)量明顯低于對照組。
[0038] 表6乳酸菌制劑對斷奶仔豬糞便微生物菌群的影響
綜上所述，本發(fā)明中經(jīng)過紫外誘變和高溫馴化得到的嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X具有良 好的耐溫性和耐消化能力，在改進后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后有較高的活菌數(shù)，并且，相應(yīng)的乳酸 菌制劑可W顯著提高斷奶仔豬的生長性能，有效地降低腹瀉率和死亡率。
[0039] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種嗜酸乳桿菌，其特征在于：所述菌株為嗜酸乳桿菌Uaciohcint/s acit/o/7Ai2us)FZU-LA1301X，保藏號為:CGMCC No. 12453,保藏日期為2016年5月 16日，保藏 單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜酸乳桿菌，其特征在于：嗜酸乳桿菌FZU-LA1301X經(jīng)過高溫 馴化，能在45°C環(huán)境中生長，具有一定的耐消化能力。3. 如權(quán)利要求1所述嗜酸乳桿菌制備獲得的菌劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于:所述菌劑中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)5.0X108 cfu/g~5.0X109cfu/g。5. 如權(quán)利要求3所述嗜酸乳桿菌菌劑在斷奶仔豬飼料添加劑中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:菌劑在仔豬飼料中的添加量為50-300g/t。
【文檔編號】C12N1/20GK106011037SQ201610634249
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月5日
【發(fā)明人】倪莉, 饒?zhí)鹛? 劉志彬, 張雯
【申請人】福州大學(xué)