身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其一是把含有身份證號(hào)碼的外源性基因片段，通過CRISPR技術(shù)，永久的插入到基因組中，其二是將含有身份證號(hào)碼的特定DNA分離出來讀取。這樣使得永久保存的DNA一直有辦法鑒定身份，即使是外面的包裝標(biāo)簽遺失或弄錯(cuò)了。其可以同樣用于微生物(包括細(xì)菌和病毒)的微生物保存。比如說SARS病毒，如果能留下一個(gè)失去活性的SARS病毒基因標(biāo)本，就可以供后人研究。
【專利說明】
身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因提取、運(yùn)輸和保存領(lǐng)域，具體涉及身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前的基因提取、運(yùn)輸和保存主要是依靠試管上的標(biāo)識(shí)，由于環(huán)節(jié)多，試管外面寫 的標(biāo)識(shí)容易弄錯(cuò)或磨損。對(duì)于國家基因庫的建立，確?；虻纳矸萦肋h(yuǎn)不被弄錯(cuò)是至關(guān)重 要的。所以，我們要在基因上面永久性的貼上用DNA編輯的身份證號(hào)碼。這樣，即使試管沒有 任何標(biāo)簽，只要樣本在，身份證號(hào)碼就在。
[0003] 將數(shù)據(jù)信息轉(zhuǎn)化為DNA信息永久保存，目前有兩種方法。一種是不將基因序列直接 插入基因組中，而是將化學(xué)物質(zhì)與基因組樣本混合，利用化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)來代表數(shù)據(jù)信息， 而此種方法的缺點(diǎn)在于解析數(shù)據(jù)信息時(shí)，不僅要對(duì)化學(xué)物質(zhì)檢測，還要對(duì)基因組樣本檢測， 這樣就比較麻煩。
[0004] 另外一種是不用CRISPR_Cas9方法，而是直接利用限制酶剪切的方法切開基因組 再將代表身份證號(hào)碼的序列連接到基因組上，此種方法的缺點(diǎn)是限制酶的堿基只有4-6個(gè)， 這樣不能保證靶向的精準(zhǔn)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 將數(shù)據(jù)信息轉(zhuǎn)化為DNA信息永久保存，目前主要還是一個(gè)設(shè)想。比如說，瑞士蘇黎 世大學(xué)的Robert Grass教授在2015年發(fā)表文章指出，從理論上來說，1克DNA可以存下整個(gè) 互聯(lián)網(wǎng)的信息。但目前還沒有人嘗試一個(gè)相對(duì)簡單而又非常實(shí)用的事情，如將中國的身份 證號(hào)碼轉(zhuǎn)換成DNA保存。同時(shí)，這兩年發(fā)展起來的基因編輯技術(shù)(CRISPR)，可以讓研究人員 非常容易的在基因組中插入新的片段。CRISPR(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats，規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列）是細(xì)菌用來抵御病毒侵襲/ 躲避哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的基因系統(tǒng)?？茖W(xué)家們利用RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶可在多種細(xì)胞(包括 iPS)的特定的基因組位點(diǎn)上進(jìn)行切割。
[0006] 本發(fā)明旨在發(fā)明便于檢測及靶向精準(zhǔn)性高的一種身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的 方法。
[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，包括:將身 份證上用到的數(shù)字0-9和字母X分別轉(zhuǎn)換成各自不同的含有兩個(gè)堿基的堿基對(duì)，將身份證號(hào) 碼按照數(shù)字和/或字母按照次序轉(zhuǎn)化為含有上述堿基對(duì)的DNA序列的設(shè)計(jì)身份證序列;在上 述DNA序列的兩條單鏈上的兩端分別加上限制酶的酶切位點(diǎn)及在每條單鏈其中一端的限制 酶的酶切位點(diǎn)的外端加上與DNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列;通過CRISPR-Cas9方法將目的基 因組中的目的位點(diǎn)切開及通過人工合成生成合成身份證序列；將人工合成的身份證序列、 T4DNA連接酶和第二緩沖液與切開后的基因組混合并在適當(dāng)溫度下反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間，使身份 證序列連接到目的位點(diǎn)上。
[0008] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，還包括：當(dāng)需要進(jìn)行身份證號(hào)碼核 對(duì)的時(shí)候，用所述限制酶進(jìn)行切割將身份證序列與基因組分離開，然后純化并測序以確定 對(duì)應(yīng)的身份證號(hào)碼。
[0009] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其中，CRISPR_Cas9方法包括:根據(jù) 目的序列人工合成sgRNA，在SgRNA引導(dǎo)下及在第一緩沖液中利用Cas9對(duì)目的基因組進(jìn)行切 割。
[0010] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其中，Cas9是一種具有切割雙鏈DNA 能力的核酸酶。
[0011]根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其中，選擇的目的序列必須含有一 個(gè)PAM序列。
[0012] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其中，PAM序列為5'-NGG-3'，其中N 選自A、T、C或G。
[0013] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法的聚光發(fā)電方法，其中，5'-NGG-3'的 5'端應(yīng)該帶有20bp左右的基因組互補(bǔ)序列以保證SgRNA的靶向的精準(zhǔn)性。
[0014] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其中，限制酶為限制性核酸內(nèi)切酶， 能夠識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行 切割。
[0015] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其中，限制酶包括BamHI和EcoRI。
[0016] 根據(jù)上述身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法的聚光發(fā)電方法，其中，在適當(dāng)溫度 下反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間為在4°C下反應(yīng)過夜或在16°C下反應(yīng)4小時(shí)左右。
[0017]有益效果
[00?8 ]本發(fā)明公開的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其一是把含有身份證號(hào)碼的外 源性基因片段，通過CRISPR技術(shù)，永久的插入到基因組中，其二是將含有身份證號(hào)碼的特定 DNA分離出來讀取。這樣使得永久保存的DNA-直有辦法鑒定身份，即使是外面的包裝標(biāo)簽 遺失或弄錯(cuò)了。其可以同樣用于微生物(包括細(xì)菌和病毒)的微生物保存。比如說SARS病毒， 如果能留下一個(gè)失去活性的SARS病毒基因標(biāo)本，就可以供后人研究。
【附圖說明】
[0019] 圖1是加上限制酶的酶切位點(diǎn)和與DNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列后的兩條身份證 序列的不意圖；
[0020] 圖2是用CRISPR-Cas9系統(tǒng)切割目標(biāo)DNA序列示意圖；
[0021]圖3是利用T4DNA連接酶將合成身份證序列插入到基因組上的示意圖；
[0022]圖4是用限制酶將身份證序列分離出來的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限 定。
[0024]首先人工合成代表身份證號(hào)碼的DNA序列，即將身份證上用到的數(shù)字0-9和字母X 轉(zhuǎn)換成含有兩個(gè)堿基的DNA序列，其由選自A、T、C和G四種堿基任意組合，其中兩個(gè)堿基也可 以選擇相同的其中一個(gè)堿基。這樣，18位數(shù)的身份證就需要36個(gè)堿基來表示。下面我們列舉 了其中一種表不方法:如表1所不：
[0025]表 1
[0027]圖1是加上限制酶的酶切位點(diǎn)和與DNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列后的兩條身份證 序列的示意圖，如圖1所示，然后，我們?cè)谏鲜鯠NA序列的兩條單鏈(圖1中所示的身份證序列 和身份證序列的互補(bǔ)序列)上的兩端分別加上限制酶的酶切位點(diǎn)及在每條單鏈其中一端的 限制酶的酶切位點(diǎn)的外端加上與DNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列（圖1中所示的互補(bǔ)序列）。其 中，兩條單鏈上加上與DNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列的一端彼此相反。
[0028] 假如我們要表示的身份證號(hào)是110425199601013838,用BamHI和EcoRI作為作為限 制酶切割，那么加上限制酶的酶切位點(diǎn)和與DNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列后的兩條身份證 序列應(yīng)該是：
[0029] 3'->5'（N代表基因組的互補(bǔ)序列）
[0030] GGATCCACACAACAAGCCACGCGCCCAAACAAACATGAATGACTTAAGNNNNN [0031] 5'->3'（N代表基因組的互補(bǔ)序列）
[0032] NNNNNCCTAGGTGTGTTGTTCGGTGCGCGGCTTTGTTTGTACTTACTGAATTC [0033]設(shè)計(jì)出身份證序列后，通過人工合成生成相應(yīng)的身份證序列。
[0034] 然后，我們通過CRISPR_Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats_Cas9)技術(shù)將基因組中的目的位點(diǎn)切開。
[0035] CRISPR_Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可 用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA，防御機(jī)制簡單地說就是在特定RNA的引導(dǎo)下，核酸酶Cas9 切割病毒或者外源DNA從而使之降解或失活。而通過人工設(shè)計(jì)RNA，可以形成具有引導(dǎo)作用 的SgRNA(單鏈引導(dǎo)RNA)，足以引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。
[0036] Cas9是一種可以切割雙鏈DNA的核酸酶，但需要有sgRNA(single guide RNA，單鏈 引導(dǎo)RNA)引導(dǎo)才能對(duì)目的基因進(jìn)行切割，因此先根據(jù)目的序列人工合成sgRNA，選擇的目的 序列必須含有一個(gè)PAM序列，雙鏈復(fù)合體結(jié)構(gòu)從此處開始形成。所謂的PAM序列即為5'-NGG-3'（N代表A、T、C、G任意一種），理論上每8個(gè)堿基就能找到一個(gè)，因此對(duì)基因組任意一處都可 以進(jìn)行編輯，這也是其它基因編輯技術(shù)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。為了保證靶向的精準(zhǔn)性，sgRNA的 5端應(yīng)該帶有20bp左右的基因組互補(bǔ)序列。
[0037] 假如我們要對(duì)基因組某一處進(jìn)行編輯且已經(jīng)知道到了該處的堿基序列，那么可以 設(shè)計(jì)如下一個(gè)sgRNA:
[0038] 3'->5'（N代表基因組的互補(bǔ)序列）
[0039] UUUUCGUGGGCUGAGCCACGGUGAAAAAGUUCAACUAUUGGCCUGAUCGGAAUAAAAUUUCGAUAAACAUCGAGAUU UUGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0040] 將Cas9、sgRNA、第一緩沖液與基因組混合，在適當(dāng)溫度反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間。第一緩沖液 選擇能夠保證Cas9和sgRNA的酶活性的緩沖液，Cas9從生物公司購買，各組分含量與反應(yīng)條 件參照說明書即可，圖2是用CRISPR-Cas9系統(tǒng)切割目標(biāo)DNA序列示意圖，過程如圖2所示。 [0041]最后加入人工合成的身份證序列、T4DNA連接酶和第二緩沖液并在適當(dāng)溫度下反 應(yīng)適當(dāng)時(shí)間，讓身份證序列連接到目的位點(diǎn)上。第二緩沖液選擇能夠保證T4DNA連接酶的酶 活性的緩沖液，T4DNA連接酶從生物公司購買，各組分含量與反應(yīng)條件參照說明書即可，圖3 是利用T4DNA連接酶將合成身份證序列插入到基因組上的示意圖，具體過程如圖3所示。 [0042]當(dāng)需要進(jìn)行身份證號(hào)碼核對(duì)的時(shí)候，用前述設(shè)計(jì)的限制酶進(jìn)行切割將身份證序列 與基因組分離開，然后純化并測序就可以知道對(duì)應(yīng)的身份證號(hào)碼了，純化步驟可以采用小 片段DNA的瓊脂糖凝膠回收，使用DNA切膠回收試劑盒即可，具體操作根據(jù)試劑盒的不同而 不同。圖4是用限制酶將身份證序列分離出來的示意圖，具體過程如圖4所示。
[0043]如要分離前述實(shí)施例中設(shè)計(jì)的身份證序列的話，那么需要使用BamHI和EcoRI兩種 限制酶進(jìn)行切割，便會(huì)得到如下結(jié)果：
[0044] 3'->5'（N代表基因組的互補(bǔ)序列）
[0045] NNNNNG GATCCACACAACAAGCCACGCGCCGAAACAAACATGAATGACTTAA GNNNNN
[0046] NNNNNCCTAG GTGTGTTGTTCGGTGCGCGGCTTTGTTTGTACTTACTG AATTCNNNNN
[0047] 5'->3'（N代表基因組的互補(bǔ)序列）
[0048] 將片段純化即得到：
[0049] 3， GATCCACACAACAAGCCACGCGCCGAAACAAACATGAATGACTTAA 5，
[0050] 5' GTGTGTTGTTCGGTGCFCGGCTTTGTTTGTACTTACTG 3'
[0051 ] 再對(duì)此片段進(jìn)行測序即可得到對(duì)應(yīng)的身份證號(hào)碼：110425199601013838。
[0052]以上所述，僅是本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，并非對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做任何形式上 的限制。凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例做任何簡單修改，形式變化和修飾，均落 入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:所述方法包括： 將身份證上用到的數(shù)字0-9和字母X分別轉(zhuǎn)換成各自不同的含有兩個(gè)堿基的堿基對(duì)，將 身份證號(hào)碼按照數(shù)字和/或字母按照次序轉(zhuǎn)化為含有上述堿基對(duì)的DNA序列的設(shè)計(jì)身份證 序列； 在上述DNA序列的兩條單鏈上的兩端分別加上限制酶的酶切位點(diǎn)及在每條單鏈其中一 端的限制酶的酶切位點(diǎn)的外端加上與DNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列及通過人工合成生成合 成身份證序列； 通過CRISPR-Cas9方法將目的基因組中的目的位點(diǎn)切開； 將人工合成的身份證序列、T4 DNA連接酶和第二緩沖液與切開后的基因組混合并在適 當(dāng)溫度下反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間，使身份證序列連接到目的位點(diǎn)上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:所述方法包 括：當(dāng)需要進(jìn)行身份證號(hào)碼核對(duì)的時(shí)候，用所述限制酶進(jìn)行切割將身份證序列與基因組分 離開，然后純化并測序以確定對(duì)應(yīng)的身份證號(hào)碼。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于：所述 CRISPR-Cas9方法包括:根據(jù)目的序列人工合成sgRNA，在sgRNA引導(dǎo)下及在第一緩沖液中利 用Cas9對(duì)目的基因組進(jìn)行切割。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:所述Cas9是 一種具有切割雙鏈DNA能力的核酸酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:選擇的所述 目的序列必須含有一個(gè)PAM序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:所述PAM序 列為5'-NGG-3'，其中N選自A、T、C或G。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于：所述5'-NGG-3'的5'端應(yīng)該帶有20bp左右的基因組互補(bǔ)序列以保證sgRNA的靶向的精準(zhǔn)性。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:所述限制酶 為限制性核酸內(nèi)切酶，能夠識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸 之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:所述限制酶 包括 BamHI 和 EcoRI。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的身份證號(hào)碼永久嵌入基因組的方法，其特征在于:在所述適 當(dāng)溫度下反應(yīng)所述適當(dāng)時(shí)間為在4°C下反應(yīng)過夜或在16°C下反應(yīng)4小時(shí)左右。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105861547SQ201610133919
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月10日
【發(fā)明人】黃捷
【申請(qǐng)人】黃捷