一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞分離技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括將蘋果果肉切成薄片的步驟，還包括將果肉薄片放置于含0.1％(W/V)離析酶的CPW溶液中，在黑暗條件下酶解0.5h的步驟。本發(fā)明具有使用的試劑簡單、過程方便并且得到的單細(xì)胞多且完整的優(yōu)點(diǎn)并且確立了一種快速分離蘋果果肉細(xì)胞的方法以及所采用的酶液組成以及酶解條件的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單個活體細(xì)胞是生命活動的基本單元和進(jìn)化的基本單位，對單個活體細(xì)胞的識 另IJ、分選及分析，能夠解析生命體系最"深"層次的異質(zhì)性和運(yùn)作機(jī)制。同時，因其不依賴于 細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增，單細(xì)胞技術(shù)在生物發(fā)育、生物能源、氣候變化、疾病診斷、食品安全、農(nóng) 業(yè)生態(tài)等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。
[0003] 分離植物精細(xì)胞用于離體培養(yǎng)，可以為通過離體有性繁殖途徑進(jìn)行植物品種改良 打下基礎(chǔ);分離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，使研究保衛(wèi)細(xì)胞本身的生理生化特性及其與氣孔功能 的關(guān)系成為可能；分離維管束組織和韌皮部組織細(xì)胞，可以進(jìn)行組織特異表達(dá)基因的鑒定 (Van Beijnum,Rousch et al.2008)。利用棉纖維單細(xì)胞研究細(xì)胞壁和纖維素的形成過程， 能幫助人們更好地提高棉纖維的質(zhì)量(Haigler,Betancur et al.2012)。
[0004] 目前，研究基因表達(dá)都是一群細(xì)胞的基因表達(dá)，這種表達(dá)實(shí)際上每個細(xì)胞特異表 達(dá)的平均情況，但是單個細(xì)胞的基因表達(dá)分析能夠提供隱藏在群體細(xì)胞中單個細(xì)胞發(fā)育的 新機(jī)理（Narsinh, Ning et al. 2011 ;Bloch and Yalovsky 2013)。細(xì)胞膜上有各種離子通 道如鈣離子通道、鉀離子通道及鈉離子通道等，這些通道調(diào)節(jié)離子進(jìn)出，利用膜片鉗技術(shù)可 研究單個細(xì)胞的離子通道的特性等，從而深入地研究生物體信號傳導(dǎo)、細(xì)胞滲透壓、細(xì)胞營 養(yǎng)及抗逆性等各種生理機(jī)制。李樂功等利用膜片鉗等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了控制K +通道的流向轉(zhuǎn)換 機(jī)制，揭開了使同一離子通道的離子流向發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因素(Li,Liu et al.2008)。果實(shí) 的發(fā)育過程就是果肉細(xì)胞發(fā)育的過程，決定著果實(shí)的硬度、甜度、營養(yǎng)物質(zhì)的含量等，與果 實(shí)貯藏時間長短、病害發(fā)生等都有關(guān)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此研究分離有活性果肉單細(xì)胞是研究蘋果果實(shí)發(fā)育的基礎(chǔ)，本發(fā)明的目的在于 公開了一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，包括將蘋果果肉切成薄片的步驟，其中，所 述快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法還包括將果肉薄片放置于含0.1 % (W/V)離析酶的CPW溶 液中，在黑暗條件下酶解〇.5h的步驟。
[0008] 上述技術(shù)方案所述的一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，其中，所述CPW溶液的 組成成分為l〇l.〇mg/L KN03,27.2mg/L KH2P〇4,246.0mg/L MgSO4 ·7Η2〇，1480.0π^/? CaCl2 · 2H2〇,0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4 · 5H2〇,0.4mol/L甘露醇，4°C低溫保存?zhèn)溆谩?br>[0009] 上述技術(shù)方案所述的一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，其中，含0.1 % (W/V) 離析酶的CPW是通過將離析酶溶于CPW溶液中制備而成。
[0010] 上述技術(shù)方案所述的一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，其中，所述在黑暗條 件下的酶解溫度為27°C。
[0011] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0012] 1、本發(fā)明確立了一種快速分離蘋果果肉細(xì)胞的方法并確立了所采用的酶液組成 以及酶解條件。
[0013] 2、采用本發(fā)明的方法，使用的試劑簡單、過程方便并且得到的單細(xì)胞多且完整。
【附圖說明】：
[0014] 圖1為用VBL檢測細(xì)胞壁完整性和用FDA檢測細(xì)胞活性的結(jié)果圖，其中：圖IA為未分 離的細(xì)胞，經(jīng)Π )Α染色；（暗場）；圖IB: VBL檢測細(xì)胞的完整性；（暗場）；圖IC:酶解0.5h，獲得 完整單細(xì)胞;圖ID: FDA染色檢測細(xì)胞的活性(暗場）。
【具體實(shí)施方式】：
[0015] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對本發(fā)明一種快速分離蘋 果果肉單細(xì)胞的方法作進(jìn)一步的說明。
[0016] 實(shí)施例1: 一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法:
[0017] -、材料與方法：
[0018] 1 · 1材料:從青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地，取成熟富士(Malus Xdomestica Borkh. 'Fuji'）蘋果，貯藏于4°C備用。
[0019] 1.2器材與試劑：
[0020] 熒光顯微鏡(LEICA，DM2500,德國），勻漿機(jī)，低速離心機(jī)，恒溫?fù)u床，磁力攪拌器。
[0021] 1.3試驗(yàn)方法：
[0022] 1.3.1單細(xì)胞分離：
[0023] 配制CPW溶液（張寧，李威et al.2015)，101.0mg/L KN03,27.2mg/L KH2P〇4， 246 · Omg/L MgS〇4 · 7H20,1480.Omg/L CaCl2 · 2H20,0.16mg/L KI，0.025mg/L CuS〇4 · 5H20， 0.4mol/L甘露醇，4°C低溫保存?zhèn)溆?。纖維素酶，果膠酶和離析酶分別按照表1中的濃度溶于 CPW溶液中，如離析酶(Macerozyme R-10)溶于CPW溶液中，濃度是0.1% (W/V:質(zhì)量與體積 比）。
[0024] 表1酶液組成(W/V)
[0026] 將蘋果表皮以下的果肉用手術(shù)刀切成邊長0.5cm的小方塊，再徒手切成薄片。將切 好的蘋果薄片分別置于50ml的溶有I、Π 和ΙΠ 酶液組成的CPW溶液中（酶液的組成見表1 )，于 70r/min搖床中在27°C、黑暗條件振蕩酶解0.5h、Ih和2h。
[0027] 靜置后，用CPW溶液清洗3次，以洗去酶液，再移到50ml燒杯，在磁力攪拌器上攪拌 Ih后，在顯微鏡上檢測，比較各個酶液在不同處理時間的獲取單細(xì)胞結(jié)果。
[0028] 1.3.2采用VBL檢測細(xì)胞壁完整性：
[0029] VBL與植物細(xì)胞壁中的纖維素有強(qiáng)烈的親和力，在紫外光下，產(chǎn)生熒光，利用這個 特性，常被用于檢測細(xì)胞的完整性(Huang and Yan 1980)。
[0030] 米用黃祥輝和顏季瓊的方法，配制￥131^(4,4'-13丨8(4-&11；[1;[110-6-117(11'(?5^1:1171-amine-S-triazin-2-yIamino)-2，2'-stilbene disulfonic acid)細(xì)胞壁染色液(Huang and Yan 1980)。先配制0.5mol/L甘露醇，調(diào)pH為7.0(Tris)。再用甘露醇溶液配制VBL，使 VBL終濃度為0.1 %。避光，4 °C備用。
[0031] 染色步驟:第一步，吸取Iml細(xì)胞懸浮液到1.5ml離心管，吸取IOyL，滴加于載玻片 上，在顯微鏡下觀察。第二步，吸取400yL細(xì)胞懸浮液至新的離心管，加20yL上述0.1 %的 VBL，避光，染色5min。第三步，染色后，用CPW重復(fù)漂洗三次，以除去背景中的熒光。第四步， 漂洗后，懸浮于CPW中，避光，焚光顯微鏡下觀察。VBL的激發(fā)波長為345nm，發(fā)射波長為 430nm。
[0032] 1.3.3?0六檢測細(xì)胞活性：
[0033] FDA是一種非熒光的化合物，滲入活細(xì)胞后才釋放出熒光素，在藍(lán)色光激發(fā)下顯示 出綠色熒光(張先杰and李鐸2000)。
[0034] FDA常用于動植物細(xì)胞生活力的鑒定的染料（Yang 1986;Boyd，Cholewa et al. 2008)，當(dāng)活細(xì)胞具有完整細(xì)胞膜時，細(xì)胞內(nèi)Π )Α經(jīng)水解產(chǎn)生的熒光素在胞內(nèi)積累，在藍(lán) 光下產(chǎn)生綠色熒光，而死細(xì)胞，細(xì)胞膜使去了選擇透性，熒光素?zé)o法在胞內(nèi)積累，而不產(chǎn)生 焚光（Saruyama,Sakakura et al. 2013) 〇
[0035] 配制5ml 5mg/L Π )Α:先配0.65m〇VL的甘露醇，再稱取25mg雙醋酸熒光素 Π )Α，溶 于Iml丙酮，完全溶解之后，再加入上述甘露醇溶液4ml。避光，4 °C保存。取細(xì)胞懸浮液0.5ml 于1.5ml離心管，加入Π )Α染色液，使其終濃度為0.01 %，室溫下靜置5min，熒光顯微鏡下觀 察，F(xiàn)DA的最大激發(fā)波長為493nm，發(fā)射波長為510nm。發(fā)綠色熒光的為活細(xì)胞，不發(fā)熒光的為 死細(xì)胞。
[0036] 2 結(jié)果：
[0037] 不同酶液組合、酶解時間對蘋果果肉單細(xì)胞分離的影響見表2所示：
[0038] 表2不同酶液組合、酶解時間對蘋果果肉單細(xì)胞分離的影響
[0040]用0.1 % (W/V:質(zhì)量與體積比）離析酶分離蘋果果肉細(xì)胞，酶解時間為0.5h，得到11 個/IOyL單細(xì)胞，而且?guī)缀鯖]有碎片。
[0041 ]用VBL檢測細(xì)胞壁完整性和用FDA檢測細(xì)胞活性的結(jié)果見圖1所示，其中：圖IA為未 分離的細(xì)胞，經(jīng)FDA染色成為綠色，說明果肉細(xì)胞具有活性；（暗場）；圖IB: VBL檢測細(xì)胞的完 整性；（暗場）；圖IC:酶解0.5h，獲得完整單細(xì)胞;圖ID:FDA染色檢測細(xì)胞的活性(暗場）。 [0042]分離蘋果果肉單細(xì)胞過程中，在沒有酶的情況下，不能分離出果肉單細(xì)胞，用FDA 染色液染色，能夠看到堆疊的有活性的細(xì)胞群（圖1A);當(dāng)酶液中含有0.1 %纖維素酶或 0.05 %果膠酶時，獲得單細(xì)胞少，有大量碎片存在，如表2中酶液I和酶液Π ，但是當(dāng)酶液中 只含有0.1 %離析酶時，處理時間只有0.5h時，單細(xì)胞產(chǎn)量多且完整（圖1C)，當(dāng)處理時間是 Ih和2h時，雖有較多的單細(xì)胞，但是碎片較多，因此，酶液m是分離果肉單細(xì)胞的最佳酶液， 適宜酶解時間為〇. 5h(表2)。
[0043]離析酶分離得到的蘋果果肉單細(xì)胞經(jīng)VBL染色后，細(xì)胞周圍有明顯的熒光（圖IB)， 這個結(jié)果說明，經(jīng)離析酶處理果肉可以獲得完整的果肉單細(xì)胞。
[0044] 分離得到的單細(xì)胞經(jīng)FDA染色五分鐘后，細(xì)胞內(nèi)充滿了熒光物質(zhì)（圖ID )，這個結(jié)果 表明，分離得到的果肉單細(xì)胞具有活性。
[0045] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限 制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技 術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時，凡依 據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本 發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，包括將蘋果果肉切成薄片的步驟，其特征在 于:所述快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法還包括將果肉薄片放置于含0.1 % (w/ν)離析酶的 CPW溶液中，在黑暗條件下酶解0.5h的步驟。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，其特征在于:所述CPW 溶液的組成成分為l〇l.〇mg/L KN03,27.2mg/L KH2P〇4,246.0mg/L MgS〇4.7H20，1480.0mg/L CaCl2 · 2H20,0.16mg/L KI，0.025mg/L CuS〇4 · 5H20,0.4mol/L甘露醇，4°C低溫保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，其特征在于:含0.1 % (W/V)離析酶的CPW是通過將離析酶溶于CPW溶液中制備而成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法，其特征在于:所述在黑 暗條件下的酶解溫度為27°C。
【文檔編號】C12N5/04GK105861413SQ201610392631
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】屈海泳, 劉珅坤, 王永章, 管押琴, 邢文曦, 劉成連
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué), 山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院