列復(fù)制 (3SR)，包括其多重型式或組合，例如(但不限于)0LA/PCR、PCR/0LA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、 PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(也被稱作組合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-CCR)等。此類技術(shù)的描述可W見于 Sambrook等人《分子克?。∕olecular Cloning)》，第3版;Ausbel等人；《PCR引物：實(shí)驗(yàn)室手 冊（PCR PrimeriA Laboratory Manual)》，Diffenbach編，Cold Spring Harbor Press (1995);《電子方案圖書（The Electronic Protocol Book)》，化ang Bioscience(2002), Msuih等人，《臨床微生物學(xué)（J. Cl in. Micro. )》34:501-07( 1996);《核酸方案手冊（The Nucleic Acid Protocols 化n化ook)》，R.Rapley編，Humana Press,Totowa,N.J.(2002)? 及其它地方。
[0086]在一些實(shí)施例中，本文所公開的組合物、方法試劑盒和系統(tǒng)中的一種或多種可W 包括至少一種目標(biāo)特異性引物和/或至少一種銜接子(參見U.S 2012/0295819,其W全文引 用的方式并入本文中）。在一些實(shí)施例中，組合物包括多種長度為約15到約40個核巧酸的目 標(biāo)特異性引物或銜接子。在一些實(shí)施例中，組合物包括一種或多種包括一個或多個可裂解 基團(tuán)的目標(biāo)特異性引物或銜接子。在一些實(shí)施例中，一種或多種類型的可裂解基團(tuán)可W并 入目標(biāo)特異性引物或銜接子中。在一些實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W位于或接近目標(biāo)特異性 引物或銜接子的3'端。在一些實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W位于目標(biāo)特異性引物或銜接子的 末端核巧酸處、倒數(shù)第二核巧酸處、或?qū)?yīng)于小于50%核巧酸長度的任何位置處。在一些實(shí) 施例中，可裂解基團(tuán)可W并入在或接近目標(biāo)特異性引物或銜接子中央的核巧酸處。舉例來 說，40個堿基德目標(biāo)特異性引物可W在核巧酸位置15-25處包括裂解基團(tuán)。因此，目標(biāo)特異 性引物或銜接子可W在其3'端、其5'端內(nèi)或在中央位置處包括多個可裂解基團(tuán)。在一些實(shí) 施例中，目標(biāo)特異性引物的5'端僅包括非可裂解核巧酸。在一些實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W 包括經(jīng)修飾的核堿基或經(jīng)修飾的核巧酸。在一些實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W包括不在相應(yīng) 核酸中天然存在的核巧酸或核堿基。舉例來說，DNA核酸可W包括RNA核巧酸或核堿基。在一 個實(shí)例中，基于DNA的核酸可W包括尿喀晚或尿巧。在另一個實(shí)例中，基于DNA的核酸可W包 括肌巧。在一些實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W包括可W通過酶促、化學(xué)或熱手段從目標(biāo)特異性 引物或銜接子上裂解的部分。在一些實(shí)施例中，尿喀晚或尿巧部分可W使用尿喀晚DNA糖基 化酶來從目標(biāo)特異性引物或銜接子上裂解。在一些實(shí)施例中，肌巧部分可W使用hAAG或 EndoV來從目標(biāo)特異性引物或銜接子上裂解。
[0087] 在一些實(shí)施例中，目標(biāo)特異性引物、銜接子、經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列或核酸分子可W包括 一個或多個可裂解部分，在本文中也稱為可裂解基團(tuán)。任選地，所述方法可W進(jìn)一步包括使 目標(biāo)特異性引物、銜接子、經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列或核酸分子的至少一個可裂解基團(tuán)裂解。裂解可 W在所公開方法的任何其它步驟之前或之后執(zhí)行。在一些實(shí)施例中，裂解步驟在擴(kuò)增之后 并且在接合之前進(jìn)行。在一個實(shí)施例中，裂解包括在接合之前使至少一種經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列 裂解?？闪呀獠糠挚蒞存在于經(jīng)修飾的核巧酸、核巧或核堿基中。在一些實(shí)施例中，可裂解 部分可W包括不在相關(guān)目標(biāo)序列中天然存在的核堿基。在一些實(shí)施例中，尿喀晚或尿巧可 W并入基于DNA的核酸中作為可裂解基團(tuán)。在一個例示性實(shí)施例中，尿喀晚DNA糖基化酶可 W用于使可裂解基團(tuán)從核酸上裂解。在另一個實(shí)施例中，肌巧可W并入基于DNA的核酸中作 為可裂解基團(tuán)。在一個例示性實(shí)施例中，EndoV可W用于在接近肌巧殘基處裂解，并且另一 種酶(克列諾酶化Ienow))可W用于形成能夠進(jìn)行純端接合的純端片段。在另一個例示性實(shí) 施例中，酶hAAG可W用于使肌巧殘基從核酸上裂解，從而形成無堿基位點(diǎn)，所述位點(diǎn)可W由 一種或多種酶(如克列諾酶)進(jìn)一步加工W形成能夠進(jìn)行純端接合的純端片段。
[0088] 在一些實(shí)施例中，一個或多個可裂解基團(tuán)可W存在于目標(biāo)特異性引物或銜接子 中。在一些實(shí)施例中，目標(biāo)特異性引物或銜接子中一個或多個可裂解基團(tuán)的裂解可W生成 多種具有不同烙化溫度的核酸片段。在一個實(shí)施例中，在目標(biāo)特異性引物或銜接子中放置 一個或多個可裂解基團(tuán)可W通過決定在可裂解基團(tuán)裂解之后每一個核酸片段的類似最大 最小烙化溫度來調(diào)控或操控。在一些實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W是尿喀晚或尿巧部分。在一 些實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W是肌巧部分。在一些實(shí)施例中，至少50%的目標(biāo)特異性引物可 W包括至少一個可裂解基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，每一個目標(biāo)特異性引物都包括至少一個可 裂解基團(tuán)。
[0089] 在一個實(shí)施例中，執(zhí)行多重核酸擴(kuò)增，其包括a)使用一種或多種目標(biāo)特異性引物 在聚合酶存在下使一種或多種目標(biāo)序列擴(kuò)增W產(chǎn)生經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列，和b)使銜接子接合到 所述經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列W形成銜接子接合的經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列。在一些實(shí)施例中，擴(kuò)增可W在 溶液中執(zhí)行W使得經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列或目標(biāo)特異性引物不與固體載體或表面連接。在一些實(shí) 施例中，接合可W在溶液中執(zhí)行W使得經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列或銜接子不與固體載體或表面連 接。在另一個實(shí)施例中，擴(kuò)增和接合可W在溶液中執(zhí)行W使得經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列、目標(biāo)特異性 引物或銜接子不與固體載體或表面連接。
[0090] 在一些實(shí)施例中，目標(biāo)特異性引物對在引物的3'或5'端處不含有常見延伸（尾 部）。在另一個實(shí)施例中，目標(biāo)特異性引物不含有標(biāo)簽(Tag)或通用序列。在一些實(shí)施例中， 目標(biāo)特異性引物對被設(shè)計(jì)成用于消除或減少促進(jìn)非特異性擴(kuò)增形成的相互作用。
[0091] 在一個實(shí)施例中，目標(biāo)特異性引物對中每個正向和反向目標(biāo)特異性引物包含至少 一個可裂解基團(tuán)。在一個實(shí)施例中，可裂解基團(tuán)可W是尿喀晚核巧酸。在一個實(shí)施例中，在 生成經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列之后部分地或基本上去除目標(biāo)特異性引物對。在一個實(shí)施例中，所述 去除可W包括對作為經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列一部分的目標(biāo)特異性引物對進(jìn)行酶促、熱或堿處理。 在一些實(shí)施例中，進(jìn)一步處理經(jīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列W形成純端擴(kuò)增產(chǎn)物，在本文中稱為純端經(jīng) 擴(kuò)增目標(biāo)序列。
[0092] 根據(jù)各種實(shí)施例，提供用于設(shè)計(jì)引物的方法，所述方法使用允許設(shè)計(jì)跨越相關(guān)基 因組區(qū)域的寡核巧酸引物的設(shè)計(jì)流水線，同時并有各種設(shè)計(jì)準(zhǔn)則和考慮因素，包括擴(kuò)增子 大小、引物組成、潛在偏離目標(biāo)雜交W及引物的SNP重疊。在一個實(shí)施例中，設(shè)計(jì)流水線包括 若干個可W如下文所論述依次執(zhí)行的功能模塊。
[0093] 首先，在一個實(shí)施例中，序列檢索模塊可W被配置成用于基于操作者說明來檢索 與客戶所需最終產(chǎn)物相關(guān)的序列。操作者可W請求可W由染色體和基因組坐標(biāo)或由基因符 號標(biāo)志符指定的基因組區(qū)域引物對設(shè)計(jì)。在后一種情況下，序列檢索模塊可W基于外顯子 坐標(biāo)來檢索序列。操作者也可W指定是否包括5'UTR序列(未翻譯的序列）。
[0094] 第二，在一個實(shí)施例中，分析設(shè)計(jì)模塊可W被配置成用于使用設(shè)計(jì)引擎來設(shè)計(jì)引 物對，所述設(shè)計(jì)引擎可W是如Primerf的公共工具，或可W跨越由例如序列檢索模塊檢索的 整個序列區(qū)域生成引物對的另一種引物設(shè)計(jì)軟件。引物對可W選擇為跨越核巧酸序列密集 平鋪。引物設(shè)計(jì)可W是基于各種參數(shù)，包括：（1)所述引物的烙化溫度（其可W使用在John San1:aLucia,J;r.,"聚合物、啞鈴和寡核巧酸DNA最近鄰熱力學(xué)的通用觀點(diǎn)(A unified view of polymer,dumbbell,and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics)",《美國國家科學(xué)院院刊（Proc .化11 .Acad. Sci .USA)》，第95卷，1460-1465 (1998)中所闡述的最近鄰算法來計(jì)算，其內(nèi)容W全文引用的方式并入本文中），（2)引 物組成（例如，核巧酸組成（如GC含量)可W通過軟件來測定和過濾和懲罰，引物發(fā)夾形成、 引物3'端中GC含量的組成也同樣可W，并且可W評估的特異性參數(shù)是均聚核巧酸的拉伸、 發(fā)夾形成、GC含量W及擴(kuò)增子大?。?，（3)正向引物、反向引物和擴(kuò)增子的評分(評分可W相 加W獲得探針設(shè)定得分，并且所述評分可W反映擴(kuò)增子與預(yù)定參數(shù)相符的接近程度），W及 (4) 一些T轉(zhuǎn)化成U的轉(zhuǎn)化率(T可W定位W使得引物的T定界片段的Tm預(yù)測值具有最小平均 Tm)。
[00巧]第S，在一個實(shí)施例中，引物映射模塊(primer mapping module)可W被配置成使 用映射軟件（例如，e-PCR(NCBI)，參見Rotmis化ovsky等人，"用于進(jìn)行電子PCR的網(wǎng)絡(luò)服務(wù) 器（A web server for performing electronic PCR)",《核酸研究（Nucleic Acids Research)》，第32卷，W108-W112 (2004)，和Schuler/'通過電子PCR進(jìn)行序列映射 (Sequence Mapping by Electronic PCR)",《基因組研究（Genome Research)》，第7卷， 541-550 (1997)，其兩者W全文引用的方式并入，或其它類似軟件)來將引物映射到基因組 中。引物映射可W使用失配矩陣來評分。在一個實(shí)施例中，完美匹配可W得到0的評分，并且 失配引物可W得到大于0的評分。失配矩陣考慮失配位置和失配性質(zhì)。舉例來說，失配矩陣 可W為具有特定位置(例如，在3'端處的堿基、從3'端起的第二堿基、從3'端起的第=堿基、 從5'端起的第=堿基、從5'端起的第二堿基、在5'端處的堿基和其間的位置）的特定基元 (例如，44、4(：、46、〔4、0：、(：1'、64、66、61'、1'(：^6、1'1'、4-、(：-、6-、1'-、-4、-(：、-6和-1'，其中'-'指 示不明確的堿基或間隙）的每一組合指定失配評分，所述評分可W憑經(jīng)驗(yàn)導(dǎo)出，并且可W選 擇W反映較接近3'端的失配比較接近5'端的失配更傾向于較弱PCR反應(yīng)，并且因此可能一 般更大。可W為具有不明確的堿基或間隙的基元的失配評分指定與其一致的其它基元的評 分平均值(例如，可W為A-指定AA、AC和AG的評分平均值）。基于某一評分闊值命中的次數(shù)， 可W計(jì)算擴(kuò)增子消耗。
[0096] 第四，在一個實(shí)施例中，SNP模塊可W被配置成用于確定潛在SNP和重復(fù)區(qū)域:SNP 可W映射到引物中，并且基于SNP與3'端的距離，引物可W過濾為潛在候選物。類似地，如果 引物與重復(fù)區(qū)域重疊達(dá)到某一百分比，那么可W過濾出引物。
[0097] 第五，在一個實(shí)施例中，平鋪模塊可W被配置成使用W下功能:所述功能基于擴(kuò)增 子消耗(參見引物映射）W及選擇覆蓋目標(biāo)同時確保目標(biāo)用平鋪引物的選擇不依賴于可能 處于客戶請求中的其它目標(biāo)的引物組所必需的引物數(shù)目，W使得不論客戶僅請求目標(biāo)或請 求其它目標(biāo)并且不論擴(kuò)增子是否有助于覆蓋所述目標(biāo)或其它目標(biāo)，都將選擇目標(biāo)的相同引 物組。
[0098] 第六，在一個實(shí)施例中，匯集模塊可W被配置成使用匯集算法，所述匯集算法防止 擴(kuò)增子重疊并且確保集合中引物的平均數(shù)目不偏離超過預(yù)設(shè)值。
[0099] 根據(jù)一個例示性實(shí)施例，提供一種方法，其包含：（1)接收一種或多種相關(guān)基因組 區(qū)域或序列；（2)確定所接收到的一種或多種相關(guān)基因組區(qū)域或序列的一種或多種目標(biāo)序 列；（3)為所確定的一種或多種目標(biāo)序列中的每一種提供一種或多種引物對；（4)對所述一 種或多種引物對進(jìn)行評分，其中所述評分包含基于所述一種或多種引物對的計(jì)算機(jī)模擬 PCR效能的懲罰值，并且其中所述評分進(jìn)一步包含分析所述一種或多種引物對的SNP重疊； W及(5)基于多種因子來過濾所述一種或多種引物對，所述因子至少包括懲罰值和SNP重疊 分析，W鑒別與用于一種或多種相關(guān)基因組區(qū)域或序列的一種或多種候選擴(kuò)增子序列對應(yīng) 的的所過濾的引物對組。
[0100] 成功多重?cái)U(kuò)增所需的核酸材料量可W是約Ing。在一些實(shí)施例中，核酸材料量可W 是約IOng到約50、約IOng到約10化g或約Ing到約200ng核酸材料?？蒞使用更高量的輸入材 料，然而，本發(fā)明的一個方面是選擇性地使來自較低(ng)量起始材料的多種目標(biāo)序列擴(kuò)增。
[0101] 核酸標(biāo)記物的分析可W使用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)執(zhí)行，包括(但不限于)序列分 析和電泳分析。序列分析的非限制性實(shí)例包括馬克塞姆-吉爾伯特測序(Maxam-Gi Ibed sequencing)、桑格測序（Sanger sequencing)、毛細(xì)管陣列DNA測序、熱循環(huán)測序（Sears等 人,《生物技術(shù)(Biotechniques)》，13:626-633( 1992))、固相測序(Zimmerman等人,《分子細(xì) 胞生物學(xué)方法(Methods Mol.Cell Biol.)》，3:39-42(1992))、使用質(zhì)譜(如基質(zhì)輔助激光 解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS))測序（Fu等人，《自然?生物技術(shù) (Nat.Biotechnol)》，16:381-384( 1998)) W 及通過雜交測序。Chee 等人，《科學(xué)(Science)》， 274:610-614( 1996);Drmanac等人，《科學(xué)》，260:1649-1652( 1993);Drmanac等人，《自然? 生物技術(shù)》，16:54-58(1998)。電泳分析的非限制性實(shí)例包括平板凝膠電泳(如瓊脂糖或聚 丙締酷胺凝膠電泳）、毛細(xì)管電泳和變性梯度凝膠電泳。另外，下一代測序方法可W使用商 業(yè)上可獲得的試劑盒和儀器(來自W下公司，如生命技術(shù)/離子激流公司PGM或Proton、伊路 米那公司化SEQ或MiSEQ和羅氏公司（Roche)/454下一代測序系統(tǒng))執(zhí)行。
[0102] 在一些實(shí)施例中，回應(yīng)于激發(fā)光給出巧光信號的探針的量通常與擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生 的核酸的量有關(guān)。因此，在一些實(shí)施例中，巧光信號的量與擴(kuò)增反應(yīng)中形成的產(chǎn)物的量有 關(guān)。在此類實(shí)施例中，可W因此通過測量來自巧光指示劑的巧光信號的強(qiáng)度來測量擴(kuò)增產(chǎn) 物的量。
[0103] "可檢測標(biāo)記的探針"是指用于擴(kuò)增反應(yīng)、通常用于定量或?qū)崟rPCR分析W及終點(diǎn) 分析的分子。此類檢測器探針可W用于監(jiān)測目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增。在一些實(shí)施例中，存在于 擴(kuò)增反應(yīng)中的檢測器探針適用于監(jiān)測隨時間產(chǎn)生的擴(kuò)增子的量。此類檢測器探針包括(但 不限于）5'-核酸外切酶分析(本文所描述的TAQMAN皮顆針（也參見美國專利第5，538， 848號）各種莖-環(huán)分子信標(biāo)(參見例如美國專利第6,103,476號和第5,925,517號W及Tyagi 和Kramer, 1996,《自然?生物技術(shù)》14:303-308)、無莖或線性信標(biāo)（參見例如WO 99/ 21881 )、PNA Molecular Beacons?(參見例如美國專利第6,355,421 號和第6,593,091號）、 線性PNA信標(biāo)(參見例如Kubista等人，2001 ,SPIE 4264:53-58)、非FRET探針(參見例如美國 專利第6,150，097號KSunrisc最/Amplif luor?探針(美國專利第6,548,250號）、莖-環(huán)和雙 螺旋蝸型探針（Solinas等人，2001，《核酸研究（Nucleic Acids Research)》29:E96和美國 專利第6，589，743號）、凸環(huán)探針(美國專利第6，590，091號）、假結(jié)探針(美國專利第6，589， 250號）、環(huán)化子（。7。11。〇11)(美國專利第6,383,752號）、]\?；6￡。11936側(cè)探針化9〇(311 Biosciences)、發(fā)夾探針讀國專利第6，596,490號）、膚核酸(PM)光探針、自組裝納米粒子 探針和二茂鐵修飾探針，例如描述在美國專利第6，485，901號;Mhlanga等人，2001，《方法 (Methods)》25:463-471;WMtcombe等人，1999，《自然?生物技術(shù)》.17:804-807; Isacsson 等人，2000，《分子細(xì)胞探針KMolecular Cel 1 Probes). 14:321-328; Svanv化等人，2000， 《分析生物化學(xué)（Anal Biochem.)》281 :26-35; Wo Iff S等人，2001，《生物技術(shù) (Biotechn iques)》766: 769-771; Tsourkas 等人，2002,《核酸研究（Nucleic Acids Research)》.30:4208-4215; RiccelIi等人，2002，《核酸研究》30:4088-4093; Zhang等人， 2002上海.34:329-332;Maxwell等人，2002,《美國化學(xué)學(xué)會雜志（J.Am.化em. Soc.)》124: 9606-9612;化OUde等人，2002，《生物技術(shù)趨勢（Trends Biotechnol.)》20:249-56;Huang等 人，2002,《毒理學(xué)化學(xué)研究（Chem. Res. Toxicol.)》15:118-126; W及化等人，2001，美國化 學(xué)學(xué)會雜志14:11155-11161。
[0104] 檢測器探針還可W包括澤滅劑，包括（但不限于）黑桐澤滅劑（生物谷獵頭公司 (Biosearch))、愛荷華黑（Iowa Black) (IDT)、QSY澤滅劑（分子探針公司（MoIecuIar Probes)) W及二甲氨基偶氮苯甲酯(Dabsyl)和化bcel橫酸醋/簇酸醋澤滅劑(愛博克公司 (Epoch))。
[0105] 檢測器探針還可W包括兩個探針，其中例如巧光劑在一個探針上，并且澤滅劑在 另一個探針上，其中兩個探針在目標(biāo)上雜交在一起澤滅信號，或其中在目標(biāo)上雜交通過改 變巧光改變了信號特征。檢測器探針還可W包含具有S〇3而非簇酸醋基團(tuán)的巧光素染料的 橫酸醋衍生物、巧光素的亞憐酷胺形式、CY 5的亞憐酷胺形式(商業(yè)上可例如從安瑪西亞公 司(Amersham)獲得）。在一些實(shí)施例中，使用嵌入馨合劑標(biāo)記，如漠化乙錠、SYBH?Green I 和PicoGrccn篡，由此允許在不存在檢測器探針的情況下實(shí)時或終點(diǎn)觀測擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些 實(shí)施例中，實(shí)時觀測可W包含插入檢測器探針并且可W采用基于序列的檢測器探針。在一 些實(shí)施例中，檢測器探針在擴(kuò)增反應(yīng)中未雜交到互補(bǔ)序列時被至少部分澤滅，并且在擴(kuò)增 反應(yīng)中雜交到互補(bǔ)序列時至少部分未澤滅。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明教示的檢測器探針的 Tm是63-69°C，但是應(yīng)了解，通過本發(fā)明教示的引導(dǎo)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)可W產(chǎn)生具有其它Tm的檢測 器探針。在一些實(shí)施例中，探針可W進(jìn)一步包含各種修改，如小溝結(jié)合物(參見例如美國專 利號6，486，308)，用于進(jìn)一步提供所要熱力學(xué)特征。
[0106] 在一些實(shí)施例中，檢測可W基于不同被分析物質(zhì)之間的遷移速率差異經(jīng)由多種運(yùn) 動性相關(guān)分析技術(shù)中的任一種進(jìn)行。例示性運(yùn)動性相關(guān)分析技術(shù)包括電泳、色譜、質(zhì)譜、沉 降（例如梯度離屯、）、場流分級、多級提取技術(shù)等。在一些實(shí)施例中，運(yùn)動性探針可W與擴(kuò)增 產(chǎn)物雜交，并且目標(biāo)核酸序列的身份經(jīng)由洗脫運(yùn)動性探針的運(yùn)動性相關(guān)分析技術(shù)來確定， 如例如公開的P.C.T.申請W004/46344(Rosenblum等人)和W001/92579(Wenz等人)所描述。 在一些實(shí)施例中，檢測可W通過各種微陣列和相關(guān)軟件實(shí)現(xiàn)，尤其如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 (Applied Biosystems)陣列系統(tǒng)與應(yīng)用生物系統(tǒng)公司1700化學(xué)發(fā)光微陣列分析儀和其它 商業(yè)上可獲得的可自昂飛公司(Affymetrix)、安捷倫公司(Agilent) Jllumina和安瑪西亞 生物科學(xué)公司（Amersham Biosciences)獲得陣列系統(tǒng)（也參見Gerry等人,《分子生物學(xué)雜 志（J. Mol .Biol.)》292 :251-62,1999; De Bel Iis等人，《密涅瓦生物技術(shù)（Minerva Biotec)》14: 247-52,2002;和 Stears 等人，《自然?醫(yī)學(xué)（化 t. Med.)》9:14045,包括增刊， 2003)。還應(yīng)了解，檢測可W包含報(bào)告基因，其結(jié)合到反應(yīng)產(chǎn)物中，作為經(jīng)標(biāo)記引物的一部分 或歸因于擴(kuò)增期間經(jīng)標(biāo)記dNTP的結(jié)合，或例如(但不限于)經(jīng)由包含報(bào)告基因的雜交標(biāo)簽互 補(bǔ)序列或經(jīng)由整體的或連接于反應(yīng)產(chǎn)物的連接子臂連接于反應(yīng)產(chǎn)物。未標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物例如 使用質(zhì)譜的檢測也在當(dāng)前教示內(nèi)容的范圍內(nèi)。
[0107] 本發(fā)明的試劑盒還可W包含用于執(zhí)行本文所描述的一種或多種方法的說明和/或 本文所描述的一種或多種組合物或試劑的描述。說明和/或描述可W呈印刷形式，并且可W 包括于試劑盒插頁中。試劑盒還可W包括提供此類說明或描述的互聯(lián)網(wǎng)位置的書面描述。
[0108] 在一些實(shí)施例中，提供一種包含探針組和樣品的組合物，其中所述探針組特異性 地識別基因 4訂1、4〇(、81?4。、邸882、66。1?^6。1?1、皿45、1(口、邸45、]\^1'、？11(3〔