一種以甲基丙烯酸為單體的胰蛋白酶表面印跡微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程與功能高分子領(lǐng)域，具體涉及以甲基丙烯酸為功能單體制備胰蛋白酶分子表面印跡微球的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胰蛋白酶是一種堿性蛋白酶，存在于動(dòng)物胰臟中，胰蛋白酶同時(shí)也是一種蛋白質(zhì)水解酶，起消化溶解蛋白質(zhì)的作用，因此胰蛋白酶是動(dòng)物體內(nèi)主要的消化酶。另外，胰蛋白酶作為一種肽鏈內(nèi)切酶，由于能專一性地切斷蛋白多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基羧基的肽鍵部分，因此在醫(yī)藥、食品、生化技術(shù)等工業(yè)領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用[Anirudhan T S，Rejeena S R.Journal of Colloid and Interface Science, 2012, 381: 125-136]。膜蛋白酶是通過生化技術(shù)獲取的:先處理動(dòng)物胰臟組織，提取出粗胰酶液(多種酶的混合物)，然后再進(jìn)一步分離純化從而獲得純度高的胰蛋白酶。目前，從粗酶液中分離純化胰蛋白酶的方法存在有若干缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步發(fā)展新技術(shù)與新材料，促進(jìn)胰蛋白酶的分離純化過程。以分子印跡聚合物(MIPs)為固體吸附劑的分子印跡固相萃取(MIPSE)技術(shù)，在胰蛋白酶的分離純化方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]分子印跡技術(shù)是以目標(biāo)分子為模板，制備對(duì)模板分子具有特異識(shí)別功能的聚合物材料的合成技術(shù)，所制備的分子印跡聚合物(MIPs)內(nèi)部分布有大量模板分子的印跡空穴，這些空穴在尺寸大小、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)合位點(diǎn)等方面與模板分子高度地相互匹配，因此可專一性地識(shí)別與結(jié)合模板分子，因此被稱為人工抗體(Artificial antibody)或人工接受器(Artificial acceptor)[Martins N, Carreiro E P, Locati A, et al.Journal ofChromatography A, 2015, 1409: 1-10]，而且與天然抗體與受體相比較，MIPs具有優(yōu)良的機(jī)械與化學(xué)穩(wěn)定性，且易于合成，因此更具有實(shí)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于以分子印跡技術(shù)為手段，以甲基丙烯酸為功能單體，制備胰蛋白酶分子表面印跡材料。通過交聯(lián)聚乙烯醇微球表面的羥基與甲基丙烯酰氯之間的酯化反應(yīng)，將大量可聚合雙鍵甲基丙烯酰基(MAO)引入微球表面，獲得改性微球MAO-CPVA。在緩沖溶液中，單體甲基丙烯酸的羧基幾乎發(fā)生完全電離，憑借強(qiáng)烈的靜電相互作用，甲基丙烯酸自動(dòng)結(jié)合在堿性蛋白胰蛋白酶大分子周圍，形成單體-模板復(fù)合體。水溶液中過硫酸銨/亞硫酸氫鈉引發(fā)體系所產(chǎn)生的自由基，使包圍在胰蛋白酶周圍的單體甲基丙烯酸與交聯(lián)劑N，N亞甲基雙丙烯酰胺在微球MAO-CPVA表面發(fā)生接枝交聯(lián)聚合，而模板胰蛋白酶則被包裹在交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)之中，除去模板后便得到了胰蛋白酶表面印跡微球MIP-PMAA/CPVA。
[0005]本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種以甲基丙烯酸為單體的胰蛋白酶表面印跡微球的制備方法，具體實(shí)施步驟如下: 步驟一，在四口燒瓶中將質(zhì)量百分比為3~8%的交聯(lián)聚乙烯醇微球浸泡于丙酮溶液中，使其充分溶脹12h，然后加入體積百分比為4?12%的甲基丙烯酰氯及少量碳酸鈉，25?50°C下恒溫反應(yīng)7?14h，制得表面含有可聚合雙鍵的改性微球MAO-CPVA;
步驟二，在磷酸鹽緩沖溶液中加入體積百分比3~5%的甲基丙烯酸，然后按照單體與模板摩爾比為400:1?600:1的比例加入胰蛋白酶，攪拌使兩者之間發(fā)生相互作用形成主-客體復(fù)合物溶液；
步驟三，將步驟二的主-客體復(fù)合物溶液移入裝有攪拌器、溫度計(jì)和冷凝管的四口燒瓶中，加入質(zhì)量百分比為1.5~6%的改性微球MA0-CPVA，浸泡12h使其充分溶脹后再加入質(zhì)量百分比為0.1-0.4%的交聯(lián)劑N，N ’ -亞甲基雙丙烯酰胺，在通氮?dú)?0min并升溫至30?45 °C后，加入質(zhì)量百分比為0.04-0.1%的引發(fā)劑過硫酸銨，質(zhì)量百分比為0.08-0.25%的亞硫酸氫鈉，反應(yīng)時(shí)長10?15h;
步驟四，將步驟三反應(yīng)所得的印跡微球用2?3mol/L氯化鈉進(jìn)行充分的洗脫，以去除模板胰蛋白酶，然后用蒸餾水沖洗干凈印跡微球，真空干燥后得到表面含有模板孔穴的胰蛋白酶印跡微球MIP-PMAA/CPVA。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)采用水作為反應(yīng)溶劑，以單體和模板之間的靜電相互作用為基礎(chǔ)，實(shí)施胰蛋白酶的分子表面印跡，避免了傳統(tǒng)方法在有機(jī)溶劑中以氫鍵為作用力實(shí)施蛋白質(zhì)印跡時(shí)，有機(jī)溶劑對(duì)于蛋白質(zhì)的破壞。(2)采用分子表面印跡技術(shù)制備的胰蛋白酶分子表面印跡微球，通過考察其大分子識(shí)別性能，表明分子表面印跡微球?qū)σ鹊鞍酌妇哂袃?yōu)良的結(jié)合親和性和特異的識(shí)別選擇性。
【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施例1
將3g交聯(lián)聚乙烯醇微球浸泡于裝有丙酮的四口瓶中，使其溶脹12h，然后加入3mL甲基丙烯酰氯及少量碳酸鈉，在30 0C下恒溫反應(yīng)12h，制得表面含有可聚合雙鍵的改性微球MAO-CPVAj_1.37 g的胰蛋白酶溶解于50 mL的緩沖液中，然后加入2.5 mL的單體甲基丙烯酸，使它們相互作用一段時(shí)間，然后將溶液移入裝有攪拌器、溫度計(jì)和冷凝管的四口燒瓶中；再向其中加入0.4g改性微球MAO-CPVA，溶脹12h后加入交聯(lián)劑N，N ’ -亞甲基雙丙烯酰胺0.13g，通氮?dú)?0min后升溫至35°C，加入引發(fā)劑過硫酸銨0.0143g，亞硫酸氫鈉0.0072g，反應(yīng)13h ；待反應(yīng)結(jié)束后將印跡微球?yàn)V出，用3mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行模板胰蛋白酶的洗脫，以除去模板胰蛋白酶，然后用蒸餾水將印跡微球沖洗干凈，真空干燥后得到表面含有胰蛋白酶印跡孔穴的印跡微球MIP-PMAA/CPVA。
[0008]實(shí)施例2
將2g交聯(lián)聚乙烯醇微球浸泡于裝有丙酮的四口瓶中，使其溶脹12h，然后加入4mL甲基丙烯酰氯及少量碳酸鈉，在45 °C下恒溫反應(yīng)9h，制得表面含有可聚合雙鍵的改性微球MAO-CPVAj_1.8 g的胰蛋白酶溶解于50 mL的緩沖液中，然后加入3 mL的單體甲基丙烯酸，使它們相互作用一段時(shí)間，然后將溶液移入裝有攪拌器、溫度計(jì)和冷凝管的四口燒瓶中；再向其中加入0.5g改性微球MAO-CPVA，溶脹12h后加入交聯(lián)劑N，N ’ -亞甲基雙丙烯酰胺0.19g，通氮?dú)?0min后升溫至40°C，加入引發(fā)劑過硫酸銨0.02g，亞硫酸氫鈉0.0lg,反應(yīng)1h；待反應(yīng)結(jié)束后將印跡微球?yàn)V出，用2.5mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行模板胰蛋白酶的洗脫，以除去模板胰蛋白酶，然后用蒸餾水將印跡微球沖洗干凈，真空干燥后得到表面含有胰蛋白酶印跡孔穴的印跡微球MIP-PMAA/CPVA。
[0009]實(shí)施例3
將5g交聯(lián)聚乙烯醇微球浸泡于裝有丙酮的四口瓶中，使其溶脹12h，然后加入SmL甲基丙烯酰氯及少量碳酸鈉，在40 0C下恒溫反應(yīng)12h，制得表面含有可聚合雙鍵的改性微球MAO-CPVAj_1.52 g的胰蛋白酶溶解于50 mL的緩沖液中，然后加入3 mL的單體甲基丙烯酸，使它們相互作用一段時(shí)間，然后將溶液移入裝有攪拌器、溫度計(jì)和冷凝管的四口燒瓶中；再向其中加入0.8g改性微球MAO-CPVA，溶脹12h后加入交聯(lián)劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺0.17g，通氮?dú)?0min后升溫至45 °C，加入引發(fā)劑過硫酸銨0.018g，亞硫酸氫鈉0.0095g，反應(yīng)1h ；待反應(yīng)結(jié)束后將印跡微球?yàn)V出，用2.5mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行模板胰蛋白酶的洗脫，以除去模板胰蛋白酶，然后用蒸餾水將印跡微球沖洗干凈，真空干燥后得到表面含有胰蛋白酶印跡孔穴的印跡微球MIP-PMAA/CPVA。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種以甲基丙烯酸為單體的胰蛋白酶表面印跡微球的制備方法，其步驟如下: 步驟一，以交聯(lián)聚乙烯醇微球?yàn)榛|(zhì)，使其在無水丙酮中浸泡12小時(shí)充分溶脹后，再以甲基丙烯酰氯為試劑，通過其酰氯基團(tuán)與交聯(lián)聚乙烯醇微球表面羥基之間快速的酯化反應(yīng)，將交聯(lián)聚乙烯醇微球改性為表面鍵合有大量甲基丙烯?；母男晕⑶騇AO-CPVA。 步驟二，將甲基丙烯酸和胰蛋白酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，使其相互作用一定時(shí)間后形成主-客體復(fù)合物溶液。 步驟三，將改性微球MAO-CPVA浸泡于步驟二的復(fù)合物溶液中，使其充分溶脹后，加入交聯(lián)劑N，Y -亞甲基雙丙烯酰胺，在通氮?dú)獠⒓尤胍l(fā)劑的條件下使其發(fā)生交聯(lián)聚合反應(yīng)，制備胰蛋白酶分子表面印跡微球。 步驟四，將步驟三制備的分子表面印跡微球用氯化鈉水溶液進(jìn)行反復(fù)的洗脫，直至在洗脫液中檢驗(yàn)不到胰蛋白酶為止，然后用蒸餾水沖洗干凈，真空干燥后即得表面含有大量模板孔穴的胰蛋白酶分子表面印跡微球。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以甲基丙烯酸為單體的胰蛋白酶表面印跡微球的制備方法，其特征在于:步驟一中所述交聯(lián)聚乙烯醇微球的質(zhì)量百分比為3~8%，所述甲基丙烯酰氯的體積百分比為4?12%，所述酯化反應(yīng)溫度為25?50°C，反應(yīng)時(shí)間為7?14h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以甲基丙烯酸為單體的胰蛋白酶表面印跡微球的制備方法，其特征在于:步驟二中所述甲基丙烯酸的體積百分比為3~5%，所述單體甲基丙烯酸與模板胰蛋白酶的摩爾比為400:1-600:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以甲基丙烯酸為單體的胰蛋白酶表面印跡微球的制備方法，其特征在于:步驟三中所述改性微球MAO-CPVA的質(zhì)量百分比為1.5-6%，交聯(lián)劑N，N7 -亞甲基雙丙烯酰胺的質(zhì)量百分比為0.1?0.4%，引發(fā)劑過硫酸銨的質(zhì)量百分比為0.04?0.1%，亞硫酸氫鈉的質(zhì)量百分比為0.08?0.25%，所述聚合反應(yīng)的溫度為30?45°C，反應(yīng)時(shí)間為10?15h05.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種以甲基丙烯酸為單體的胰蛋白酶表面印跡微球的制備方法，其特征在于:步驟四中洗脫液氯化鈉的摩爾濃度為2?3mol/L。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種以甲基丙烯酸為功能單體制備胰蛋白酶分子表面印跡微球的方法，通過交聯(lián)聚乙烯醇微球表面的羥基與甲基丙烯酰氯之間的酯化反應(yīng)，獲得表面含有大量可聚合雙鍵的改性微球；在緩沖溶液中，甲基丙烯酸自動(dòng)結(jié)合在模板胰蛋白酶大分子周圍形成單體-模板復(fù)合體；而引發(fā)劑體系過硫酸銨/亞硫酸氫鈉產(chǎn)生的自由基，使包圍在胰蛋白酶周圍的單體甲基丙烯酸與交聯(lián)劑<i>N,Nˊ</i>-亞甲基雙丙烯酰胺在改性微球表面發(fā)生接枝交聯(lián)聚合反應(yīng)，形成包裹有模板胰蛋白酶的印跡微球產(chǎn)物，除去模板后便得到了胰蛋白酶分子表面印跡微球，該印跡微球?qū)τ谝鹊鞍酌妇哂刑禺惖淖R(shí)別選擇性，重復(fù)使用性能好、穩(wěn)定性高，對(duì)于胰蛋白酶分子表面印跡微球的制備具有積極的參考價(jià)值。
【IPC分類】C08F290/04, C08F220/06, C08F236/20, C12N9/76
【公開號(hào)】CN105669918
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610101965
【發(fā)明人】陳濤, 高保嬌, 門吉英
【申請(qǐng)人】中北大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年2月25日