為增加imp脫氫酶活性的假囊酵母屬的遺傳修飾的制作方法
【專利說明】為増加 IMP脫氫酶活性的假囊酵母屬的遺傳修飾 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及在被遺傳修飾為增加肌苷-5' -單磷酸脫氫酶活性的假囊酵母屬的生 物體中生產核黃素的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中生長所述生物體和從培養(yǎng)基分離核黃 素。本發(fā)明還涉及屬于假囊酵母屬的遺傳修飾的生物體，以及這種遺傳修飾的生物體在提 高核黃素的累積中的用途。
【背景技術】
[0002] 所有植物以及許多微生物都生產核黃素。核黃素是細胞代謝的重要組分，因為它 充當黃素輔酶黃素單核苷酸（FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)的前體，這兩者是氧化還 原反應中的重要電子載體并參與感光，DNA保護等。包括人類在內的高等真核生物不能合 成核黃素，故而核黃素是以維生素（維生素 B2)的狀態(tài)獲得的。人類的維生素 B2缺乏導致 口腔和咽部粘膜炎癥，瘙癢和皮膚褶皺的炎癥以及皮膚損傷，結膜炎，視力敏銳度減退和角 膜混濁。在嬰兒和兒童中，可能會出現(xiàn)生長抑制和體重減輕。因此，必須向人或動物膳食中 補充核黃素。因而核黃素被添加到飼料和食品中并且也可以用作食品色素，例如在蛋黃醬 或冰淇淋中。
[0003] 核黃素可通過化學或生物技術生產。化學方法合成核黃素是基于使用例如 D-核糖作為起始原料的多步驟過程。生物技術方法生產核黃素是基于幾種微生物自然 合成核黃素（特別是在合適的原料如植物油的存在下）的潛能。被稱為核黃素生產者 的微生物包括無名假絲酵母（Candida famata)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)和 假囊酵母屬物種（Stahmann, 2010, Industrial Applications, The Mycota X，第二版， Springer, Berlin, Heidelberg，第 235 - 247 頁）。
[0004] 特別地，假囊酵母屬（先前的棉阿舒囊霉屬（Ashbya);屬于酵母科 (Saccharomycetaceae)家族）的絲狀半子囊菌（hemiascomycete)真菌被鑒定為有效的核 黃素生產者。在過去幾年中，已對生產核黃素的物種棉假囊酵母（Eremothecium gossypii) 進行了深入研究和分析，并且已對其基因組測序。
[0005] 在棉假囊酵母（E. gossypii)中，發(fā)現(xiàn)核黃素生產階段與幾個核黃素生物合成基 因（例如RIB基因 RIB 1、2、3、4、5和7)的轉錄的強勁增加相關聯(lián)。因此，例如通過整合另外 的拷貝，已經(jīng)開發(fā)出過表達這些基因的核黃素生產菌株，如在W0 95/26406或W0 99/61623 中所概述的。
[0006] 此外，已經(jīng)闡明了假囊酵母屬的核黃素生物合成途徑（Fischer and Bacher (2005) Nat. Prod R印· 22:324-350)。根據(jù)對生物合成途徑的更佳理解， 可通過過表達編碼蘇氨酸醛縮酶的GLY1 (Monschau等人（1998) Appl. Environ. Microbiol. 64(11) :4283-4290)以及破壞編碼胞質絲氨酸羥甲基轉移酶的基因 SHM (Schlilpen等人（2003) Biochem J. 369:263-273)來提高在假囊酵母屬中的核黃 素生產，這兩者都干擾對生產核黃素是至關重要的GTP代謝（也參見圖1和圖2) (Stahmann, 2010, Industrial Applications, The Mycota X,第二版，Springer, Berlin, Heidelberg，235 - 247)。發(fā)現(xiàn)經(jīng)由干擾磷酸核糖胺合成來影響核黃素生產的再一個重要 的調芐基因是編碼磷酸核糖基焦磷酸酰胺轉移酶的ADE4,其可以被提供為反饋抗性版本 (Jimenez 等人（2005) Appl. Environ. Microbiol. 71:5743-5751) 〇
[0007] 然而，盡管有這些發(fā)展，但合成效率和生產的核黃素的量（特別是在假囊酵母屬 真菌的遺傳背景下）仍非最佳，而對于食品級和飼料級核黃素的需求不斷提高。
[0008] 因此，需要允許在合適的生物體如假囊酵母屬的真菌中進一步增加核黃素產量和 累積的手段和方法。
[0009] 發(fā)明目的和內容
[0010] 本發(fā)明解決了這一需要并提供了在假囊酵母屬的遺傳修飾的生物體中生產核黃 素的方法，其中所述修飾增加了肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的活性，并使得相比于不具有遺傳 修飾的生物體而言核黃素生產得到增加，所述不具有遺傳修飾的生物體與所述被遺傳修飾 的生物體在相同條件下培養(yǎng)。
[0011]因此，本發(fā)明在第一方面提供了在假囊酵母屬的生物體中生產核黃素的方法，所 述生物體被遺傳修飾為相比于不具有遺傳修飾且與所述被遺傳修飾的生物體在相同條件 下培養(yǎng)的生物體而言增加了肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的活性，所述方法包括在合適的培養(yǎng) 基中生長所述生物體和從培養(yǎng)基分離核黃素。
[0012] 本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過增加肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的活性，使得核黃素 的生產或累積的顯著增加成為可能。
[0013] 使用假囊酵母屬比使用其它微生物提供了若干優(yōu)點。已經(jīng)深入研究并分析了 代表性的物種棉假囊酵母，其基因組已被測序，并存在若干可用的允許對其遺傳操作和 工程改造的分子工具。此外，可以證實假囊酵母屬能夠在不同的油源和含油廢物（Park 等人（2004) J.Amer. Oil Chem.Soc. 81:57-62)，以及甘油（Ribeiro 等人（2012) J. Basic Microbiol. 52:582-589)中生長，從而允許高效率使用這些廉價的能源作為生產核黃素的 原料。
[0014] 在又一個方面，本發(fā)明涉及一種屬于假囊酵母屬的累積核黃素的生物體，其被遺 傳修飾為在所述生物體中的肌苷-5' -單磷酸脫氫酶活性相比于不具有遺傳修飾的生物體 得以增加，所述不具有遺傳修飾的生物體與所述被遺傳修飾的生物體在相同條件下培養(yǎng)。
[0015] 在如上定義的方法或生物體的優(yōu)選實施方案中，被遺傳修飾的生物體相比于不具 有遺傳修飾的可比較的生物體能夠累積更多的核黃素。
[0016] 在本發(fā)明的進一步優(yōu)選的實施方案中，所述肌苷_5' -單磷酸脫氫酶活性的增加 是由于編碼肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的核酸分子的過表達。
[0017] 在更優(yōu)選的實施方案中，所述編碼肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的核酸分子的過表達 是由強啟動子（優(yōu)選GH)啟動子）完成，或通過在生物體的基因組中提供至少第二拷貝的 編碼肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的核酸分子來完成。
[0018] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案，所述編碼肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的核酸分子包 括選自以下組中的核酸序列：
[0019] (a)根據(jù)SEQ ID No. 1或2的任一的核酸序列或其功能性部分；
[0020] (b)編碼根據(jù)SEQ ID No. 3的多肽的核酸序列或其功能性部分或變體；和
[0021] (C)與根據(jù)SEQ ID No. 1或2的任一的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核 酸序列。
[0022] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，如上文所定義的所述遺傳修飾的生物體包括至 少一種另外的遺傳修飾。
[0023] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述另外的遺傳修飾導致選自下組的至少一種活 性的改變：
[0024] ⑴ GLY1 ；
[0025] (ii) SHM2 ；
[0026] (iii) ADE4 ；
[0027] (iv) PRS 2, 4 ；
[0028] (v) PRS 3 ；
[0029] (vi) MLS1 ；
[0030] (vii) BAS1
[0031] (viii) RIB 1 ；
[0032] (ix) RIB 2 ；
[0033] (x) RIB 3 ；
[0034] (xi) RIB 4 ；
[0035] (xii) RIB 5 ；
[0036] (xiii) RIB 7 ；
[0037] (xiv) FAT1 ；
[0038] (xv) P0X1 ；
[0039] (xvi) F0X2 ；
[0040] (xvii) P0T1/F0X3 ；
[0041] (xviii) ADE12 ;和
[0042] (xix) GUAl〇
[0043] 在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述另外的遺傳修飾導致至少一種下述改變：
[0044] ⑴GLY1活性增加；和/或
[0045] (ii) SHM2活性降低或消除；和/或
[0046] (iii)ADE4活性增加和/或提供作為反饋抑制抗性的版本；和/或
[0047] (iv) PRS 2, 4活性增加；和/或
[0048] (v)PRS 3活性增加；和/或
[0049] (vi)MLSl活性增加；和/或
[0050] (vii)BAS1活性降低或消除；和/或
[0051] (viii)RIB 1活性增加；和/或
[0052] (ix) RIB 2活性增加；和/或
[0053] (X) RIB 3活性增加；和/或
[0054] (xi) RIB 4活性增加；和/或
[0055] (xii)RIB 5活性增加；和/或
[0056] (xiii)RIB 7活性增加；和/或
[0057] (xiv)FATl活性增加；和/或；
[0058] (xv)POXl活性增加；和/或；
[0059] (xvi) F0X2活性增加；和/或；
[0060] (xvii)P0Tl/F0X3 活性增加；和 / 或；
[0061] (xviii)ADE12活性降低或消除；和/或
[0062] (xix)GUAl 活性增加。
[0063] 在進一步的方面，本發(fā)明涉及編碼肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的核酸分子在增加核 黃素在假囊酵母屬的生物體中的累積中的用途。
[0064] 在所述用途的優(yōu)選實施方案中，編碼肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的核酸分子通過強 啟動子過表達，或者通過在生物體的基因組中提供至少第二拷貝的編碼肌苷-5' -單磷酸 脫氫酶的核酸分子來過表達。
[0065] 在所述用途的進一步優(yōu)選的實施方案中，編碼肌苷_5' -單磷酸脫氫酶的核酸分 子包括選自以下組的核酸序列：
[0066] (a)根據(jù)SEQ ID No. 1或2的任一的核酸序列或其功能性部分；
[0067] (b)編碼根據(jù)SEQ ID No. 3的多肽的核酸序列或其功能性部分或變體；和
[0068] (c)與根據(jù)SEQ ID No. 1或2的任一的核酸序列具有至少70%的序列同一性的核 酸序列。
[0069] 在另一個方面，本發(fā)明涉及使用如上文所定義的生物體生產核黃素。
[0070] 在如上文所定義的方法、用途或生物體的特別優(yōu)選實施方案中，所述屬于假囊酵 母屬的生物體是物種阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyi)，榛針孢酵母（Eremothecium coryli)，Eremothecium cymbalariae，棉假囊酉孝母，Eremothecium sinecaudum 或假囊酉孝母 屬物種CID1339。
[0071] 附圖的簡要說明
[0072] 圖1繪示了靶向核黃素（維生素 B2)的代謝通量。核黃素是從脂肪酸通過乙 醛酸循環(huán)，糖異生，戊糖磷酸途徑以及嘌呤和核黃素合成途徑來生產（根據(jù)Kato and Park (2012) Biotechnol. Letters 34:611-618 進行修改）。
[0073] 圖2示出了在棉假囊酵母中的從頭嘌呤途徑的示意圖。
[0074] 簡稱：ADE4，磷酸核糖焦磷酸（PRPP)轉酰胺酶；ADE12，腺苷酸琥珀酸合成酶； 頂D3,頂P脫氫酶；GUA1，GMP合成酶；頂P，肌苷一磷酸；XMP，黃苷一磷酸；GMP，鳥苷一磷酸； GTP，鳥苷三磷酸；AMP，腺苷一磷酸
[0075] 圖3繪示了為特異性增加頂PDH的活性而產生的用于整合入棉假囊酵母基因組的 頂D3過表達模塊。
[0076] 簡稱：KanMX4,遺傳抗性標記；homA/homB，基因組整合位點；ΙοχΡΙ和loxP2，CRE 重組酶的重組位點；GPDp，棉假囊酵母GPD基因的啟動子；頂D3,編碼頂PDH的基因的5'部 分
[0077] 圖4示出了相比于缺乏本發(fā)明的遺傳修飾的參照菌株ATCC 10895,在棉 假囊酵母GH)啟動子控制下，在過表達Π ?3基因的棉假囊酵母工程改造菌株ATCC 10895: :GPDp-M)3中的核黃素產量。
[0078] 圖5示出Ag頂PDH- Δ Bateman的晶體結構。
[0079] a)具有垂直于紙面的4重對稱軸的Ag頂PDH- Δ Bateman四聚體結構的帶狀圖 (Ribbon representation)。插圖更具體地示出在單體之間更具體的界面。
[0080] b) Ag頂PDH- Δ Bateman未配位的結構以及與頂P和XMP復合的結構疊加。
[0081] 發(fā)明詳述
[0082] 本發(fā)明涉及允許通過使用屬于假囊酵母屬（先前的棉阿舒囊霉屬（Ashbya))的 被遺傳修飾為增加肌苷-5' -單磷酸脫氫酶活性的生物體來生產核黃素的改進的方法和手 段。
[0083] 雖然將針對特定實施方案來描述本發(fā)明，這種描述不應在局限的意義上進行解 釋。
[0084] 在詳細描述本發(fā)明示例性的實施方案之前，給出對于理解本發(fā)明重要的定義。如 在本說明書和所附權利要求中所使用的，單數(shù)形式"一"和"一個"也包括相應的復數(shù)形式， 除非上下文另有明確說明。在本發(fā)明的上下文中，術語"大約"和"近似"表示本領域技術人 員能夠理解的仍確保所討論特征的技術效果的精確度的區(qū)間。該術語通常表示從所指示的 數(shù)值偏差±20%，優(yōu)選±15%，更優(yōu)選±10%，甚至更優(yōu)選±5%。但應該理解的是，術語 "包括"不是限制性的。出于本發(fā)明的目的，術語"由...組成"被認為是術語"包括"的優(yōu)選 實施方案。如果在下文中將一個組定義為包括至少某個數(shù)量的實施方案，這意味著還包括 優(yōu)選僅由這些實施方案組成的組。此外，在說明書和在權利要求中的術語"第一"，"第二"， "第三"或"（a) "，" (b) "，"（c) "，"（d) "等之類的被用來區(qū)分相似的要素并且不一定描述次 序或時序。應當理解的是，如此使用的術語在適當?shù)那闆r下是可互換的并且在此描述的本 發(fā)明的實施方案能夠以除了本文描述或說明以外的其他次序來操作。如果術語"第一"，"第 二"，"第三"或"（a) "，"（b) "，"（c) "，"⑷"，" i "，" ii "等涉及方法或用途或測定法的步驟， 那么在步驟之間沒有時間或時間間隔連貫性，即步驟可以同時進行或者這些步驟之間有可 以存在幾秒鐘，幾分鐘，幾小時，幾天，幾周，幾個月甚至幾年的時間間隔，除非在本申請中 另有說明，如在上下文中提出。但是應當理解，本發(fā)明并不限于在此描述的具體方法，方案， 反應試劑等，因為這些都可以變化。也可以理解的是，本文所使用的術語僅用于描述具體實 施方案的目的，并且不意圖限制本發(fā)明，其僅由所附的權利要求限定。除非另有定義，本文 使用的所有技術和科學術語具有與本領域的普通技術人員通常的理解相同的含義。
[0085] 正如上文提到的，本發(fā)明在一個方面涉及在假囊酵母屬的被遺傳修飾的生物體中 生產核黃素的方法，其中所述遺傳修飾使肌苷-5' -單磷酸脫氫酶的活性相比不具有遺傳 修飾且與所述被遺傳修飾的生物體在相同條件下培養(yǎng)的生物體得以增加，所述方法包括：
[0086] ( i )在合適的培養(yǎng)基中生長所述生物體；和
[0087] (ii)從培養(yǎng)基分咼核黃素。
[0088] 優(yōu)選地，生物體是在脂肪酸油的存在下和任選在非脂質碳源存在下生長。
[0089] 如本文所用的術語"屬于假囊酵母屬的生物體"或"假囊酵母屬生物體"指的是 任何屬于假囊酵母屬的生物體，假囊酵母屬以前被稱為棉阿舒囊霉屬和/或與棉阿舒囊霉 屬屬同義。這個組至少包括物種阿舒假囊酵母，榛針孢酵母，Eremothecium cymbalariae， 棉假囊酵母（先前的Ashbya gossypii)，Eremothecium sinecaudum和假囊酵母屬物種 CID1339。進一步包括這些物種的變體、克隆或基于這些物種的修飾的生物體。
[0090] 如本文所用的術語"修飾的生物體"指的是假囊酵母屬的野生型物種通過誘變和 選擇和/或基因工程改造的修飾，或者指的是已被遺傳修飾的生物體的進一步修飾，例如 為增加核黃素的生產而之前工程改造過一個或多個基因的假囊酵母屬菌株，或者為任何其 他目的被修飾或工程改造過的假囊酵母屬菌株。該術語具體包括通過普通的誘變方法如化 學或UV誘變或差異誘變獲得的假囊酵母屬種。在優(yōu)選的實施方案中，假囊酵母屬的生物體 是棉假囊酵母，而在更優(yōu)選的實施方案中是棉假囊酵母的菌株ATCC 10895的。
[0091] 如本文使用的術語"不具有遺傳修飾的生物體"指的是沒有為了增加肌苷_5' -單 磷酸脫氫酶活性而進行過遺傳修飾，并且除此之外，與本發(fā)明的被遺傳修飾的生物體具有 相同的遺傳組成的生物體，即與本發(fā)明的被遺傳修飾的生物體的唯一的遺傳差異是本發(fā)明 的遺傳修飾。因此，不具有遺傳修飾的生物體是引入本發(fā)明遺傳修飾的親本菌株，優(yōu)選是棉 假囊酵母菌株ATCC 10895。親本菌株可以不包括任何遺傳修飾，或者可以包括除本發(fā)明以 外的遺傳修飾。
[0092] 如本文使用的術語"在合適的培養(yǎng)基中生長所述生物體"指的是使用任何本領域 技術人員已知的、允許如本文所限定的生物體生長并且適合核黃素的合成和/或累積的合 適的手段和方法。生長可以按分批工藝或連續(xù)發(fā)酵工藝進行。優(yōu)選地，生物體是在脂肪酸 油的存在下和任選在非脂質碳源存在下生長。
[0093] 進行分批或連續(xù)發(fā)酵工藝的方法是本領域技術人員公知的，并在文獻中有描述。 培養(yǎng)可以在特定的溫度條件下進行，如在15°C和45°C之間，優(yōu)選在20°C至40°C或15°C和 30°C，更優(yōu)選在20°C和30°C之間，最優(yōu)選在28°C。在另一個實施方案中，培養(yǎng)可以在廣泛的 pH范圍進行，例如，在pH 6和pH 9之間，優(yōu)選在pH 6. 5和8. 5之間，更優(yōu)選在6. 7和7. 5 之間，最優(yōu)選在6. 8和7之間。
[0094] 如本文所用的術語"脂肪酸油"指的是廢油、非食用油或廉價的種子油。這樣的油 的優(yōu)選例子是大豆油或菜籽油。脂肪酸油可以任何合適的量或濃度存在于培養(yǎng)基中，例如 以 5% (v/v)至 40% (v/v)的濃度，例如以 5%、7·5%、10%、12·5%、15%、17·5%、20%、 22. 5%、25%、27· 5%、30%、32· 5%、35%、37· 5%或 40% 的濃度。優(yōu)選使用約 10% 的濃度。
[0095] 如本文所用的術語"在非脂質碳源存在下"指的是培養(yǎng)是在盡管不屬于脂質的組 卻提供碳原子源的營養(yǎng)物質的存在下進行。優(yōu)選的是，培養(yǎng)可以在糖營養(yǎng)物質存在下進行， 如在葡萄糖、蔗糖、果糖等存在下進行。
[0096] 在進一步具體的實施方案中，培養(yǎng)基可包含附加物質。這種附加物質的一個例子 是大豆粉。大豆粉可優(yōu)選以1% (w/v)_5% (w/v)的濃度來提供，例如1%、2%、3%、4%、 5% (w/v)。大豆粉是一種復合培養(yǎng)基，其典型地包括蛋白質、碳水化合物和鹽。
[0097] 附加物質的另一個例子是甘氨酸。甘氨酸優(yōu)選以1 % (w/v)-5% (w/v)的濃度來 提供，例如 1%、2%、3%、4%、5% (w/v)。
[0098] 在一個非常具體的實施方案中，培養(yǎng)基可包含以下成分：酵母提取物、大豆粉、甘 氨酸、谷氨酸鈉、KH 2P04、MgS04、DL-甲硫氨酸、肌醇、甲酸鈉、尿素和大豆油。在特別優(yōu)選的 實施方案中，培養(yǎng)基可包含如下面實施例中所述的濃度和量的成分。
[0099] 如本文所用的術語"從細胞和培養(yǎng)基中分離核黃素"指的是任何用于從細胞中 提取核黃素并將核黃素與細胞碎片和培養(yǎng)基成分分離的適當?shù)姆椒?。在?yōu)選的實施方 案中，分離可以按在 Stahmann，Industrial Applications，第二版，The Mycota Χ，Μ· Hofrichter (編輯），Springer Verlag Berlin Heidelberg, 2010,第235-247頁中所述來進 行。純化方法也描述于US 4, 165, 250 ;Kale 等人（2008)Biotechnology and Fermentation Process, Osprey Publishing ;ΕΡ Ο 730 034 A1 以及 TO 2005/014594。
[0100] 如本文所用的術語"生產核黃素"意指假囊酵母屬生物體能夠合成并累積核黃素。 術語"累積核黃素"意指合成的核黃素被存儲在細胞內和/或排出到周圍介質中，在這兩種 情況下導致在細胞培養(yǎng)物中的核黃素濃度的整體增加。在具體的實施方案中，累積可在合 適的分離工藝之后變得可辨別，在所述工藝中獲得由細胞產生的所有核黃素，即包括儲存 在細胞內的核黃素和排出的核黃素。這樣的工藝已經(jīng)如上文所述。
[0101] 在本發(fā)明的上下文中所指的核黃素生產，典型