集病毒上清液用來(lái)將人RXR轉(zhuǎn)換為RAW264.7或F9胚胎癌細(xì)胞。感染細(xì)胞通過嘌呤霉素(2g/ml)形成轉(zhuǎn)化株2周后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞即成為穩(wěn)定的細(xì)胞系。
[0042]無(wú)限增值的骨髓源性巨噬細(xì)胞制備方法參見Palleroni等1991 ；zhou等2008。
[0043]poly 1:C、poly dA: dT 和 siRNA 轉(zhuǎn)染:
poly 1:C與poly dA: dT在六孔板轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體2000溶解于改良型DMEM培養(yǎng)基5分鐘，2g poly 1:C或2g poly dA: dT溶解于改良型DMEM培養(yǎng)基，將以上脂質(zhì)體2000溶液以及poly 1:C或poly dA: dT溶液混合，室溫培養(yǎng)15分鐘，隨后，混合液加入含有1.6ml新鮮培養(yǎng)基的細(xì)胞中。酶聯(lián)免疫吸附法中的轉(zhuǎn)染試劑(polyplus制備公司)用做小干擾RNA的轉(zhuǎn)染。根據(jù)廠家說(shuō)明，將1nM對(duì)照組小干擾RNA或所示小干擾RNA轉(zhuǎn)染J2骨髓源性巨噬細(xì)胞中。
[0044]統(tǒng)計(jì)方法:病毒滴度曲線使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。對(duì)于其他數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性，通過 2 tailed unpaired t test, 2-tailed Mann-ffhitney U test 確定 PFU 數(shù)據(jù)，視情況使用1-way ANOVA corrected多重比較法。P取值小于等于0.05，則被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。所有計(jì)算均使用GraphPad Software Inc.的Windows的Prism軟件程序。PFU數(shù)據(jù)中的橫條為各例的平均值，各圖中的誤差條表示結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)和重復(fù)數(shù)據(jù)。
[0045]實(shí)施例1
RXR的表達(dá)調(diào)控著宿主易感性的水泡型口炎病毒的感染:
我們以往的基因研究已經(jīng)確立了一種新型的干擾素調(diào)節(jié)因子3依賴性但干擾素非依賴性的機(jī)制來(lái)下調(diào)RXR的表達(dá)(Chow等2006)。通過不同類型的病毒感染來(lái)確定RXR的表達(dá)水平，骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞被水泡型口炎病毒感染。結(jié)果表明，感染以上病毒后引起RXR的表達(dá)下調(diào)(如圖1A所示XRXR基因的抑制并不是由于感染后細(xì)胞狀態(tài)改變引起，因?yàn)長(zhǎng)32控制基因沒有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。給予RNA病毒類似物poly I:C和DNA病毒類似物polydA:dT，可以激活細(xì)胞內(nèi)病毒，也顯著抑制在骨髓巨噬細(xì)胞中RXR的表達(dá)。(如圖1B所示)更重要的是，它證實(shí)了這種抑制是宿主反應(yīng)抗病毒刺激產(chǎn)生而不是病毒直接抑制宿主基因產(chǎn)生的。為了確定RXR在宿主的免疫反應(yīng)在病毒感染過程中是否起到作用，可以持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)人類RXR，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染產(chǎn)生pBABE控制載體。(如圖1C所示)水泡型口炎病毒在人類RXR中感染引起過度表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞系比對(duì)照組的細(xì)胞病毒載量更多。這個(gè)結(jié)果在不同的群體之間以及單細(xì)胞克隆持續(xù)表達(dá)人類RXR之間是一致的(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明RXR的過度表達(dá)增加宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的易感性。
[0046]為了進(jìn)一步明確RXR在宿主抗病毒感染中的作用，野生型RXR和缺乏F9胚胎癌細(xì)胞給予注射水泡型口炎病毒，通過噬菌斑測(cè)定RXR缺乏感染后細(xì)胞明顯比野生型細(xì)胞對(duì)水泡型口炎病毒更具有抵抗性。(如圖1E和IF所示)為了確定這種差異是否為RXR依賴性，RXR缺乏F9細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染重新建立人類RXR以及pBABE控制載體。給予三種不同的人類RXR注射水泡型口炎病毒比給予RXR缺乏F9細(xì)胞系重塑pBABE控制產(chǎn)生更高的病毒滴度。(如圖1G-1H所示)這些結(jié)果表明RXR的缺乏降低了水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。
[0047]綜上所述，在RXR過度表達(dá)的細(xì)胞給予更多病毒感染以及RXR缺乏細(xì)胞給予較少的病毒感染，說(shuō)明RXR表達(dá)水平可能調(diào)控水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。
[0048]實(shí)施例2
[0049]RXR激動(dòng)劑及其拮抗劑調(diào)節(jié)水泡型口炎病毒注射的巨噬細(xì)胞的宿主防御功能:
[0050]配體與RXR相結(jié)合可以激活其下游通路，且充分激活。為了探討RXR配體激活是否能影響病毒感染，RAW264.7細(xì)胞給予RXR特異性激動(dòng)劑Ig268和AGN194204進(jìn)行過夜預(yù)處理，之后感染水泡型口炎病毒。通過菌斑實(shí)驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RXR過度表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，配體激活組的RXR給予兩種刺激劑之后顯著增強(qiáng)其水泡型口炎病毒感染水平。(如圖7A所示)與此相似的是，給予9-順式維甲酸(RXR新型配體)治療，也可以增加RAW264.7細(xì)胞系對(duì)水泡型口炎病毒感染的易感性，并且呈劑量依賴效應(yīng)(維甲酸劑量范圍16nM-20nM)(如圖2B和7B所示)，相反，當(dāng)給予特異性RXR拮抗劑HX531后，(如圖2C所示)RAW264.7細(xì)胞系出現(xiàn)了對(duì)水泡型口炎病毒感染的抵抗增加。感染后我們采用GFP，是考慮到可以通過熒光顯微鏡來(lái)觀察感染后細(xì)胞的形態(tài)。顯然，與給予DMSO的對(duì)照組相比，給予維甲酸處理的細(xì)胞VSV感染更多、給予HX531處理的細(xì)胞VSV感染較少。(如圖2C所示)F9細(xì)胞系，給予AGN194204后增加野生型細(xì)胞對(duì)病毒的易感性，對(duì)RXR缺乏的細(xì)胞沒有影響，這一結(jié)果說(shuō)明配體反應(yīng)是RXR特異性的(如圖2D所示)。為了進(jìn)一步確定這一特異性配體反應(yīng)，RXR缺乏F9細(xì)胞重新再造給予人類RXR，并選擇單克隆細(xì)胞備用。給予AGN194204后，三種單克隆細(xì)胞中，RXR缺乏的細(xì)胞系通過人類RXR的再造，對(duì)病毒感染變得更具易感性。(如圖2E所示)為了研究RXR是否可以調(diào)節(jié)VSV蛋白表達(dá)，人類RXR過度表達(dá)RAW264.7細(xì)胞給予
9-順式維甲酸和HX531，然后給予其中包含VSV-G熒光素酶受體無(wú)法復(fù)制的VSV假病毒感染。(Aguilar等2006)。HX531降低VSV熒光素酶受體活化，而9順式維甲酸增加其活化。(如圖2F所示)因?yàn)榧俨《緵]有復(fù)制能力，受體表達(dá)增加意味著RXR激活病毒蛋白表達(dá)的活化。為了分別闡述這一數(shù)據(jù)，RAW264.7細(xì)胞預(yù)先給予DMSO處理，野生型VSV給予9順式維甲酸處理，收集其產(chǎn)物，免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)VSV-G蛋白定量。VSV-G蛋白水平在人RXR過度表達(dá)的RAW 264.7細(xì)胞中比對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)要高。給予9順式維甲酸細(xì)胞組VSV-G蛋白水平顯著上升。(如圖2G所示)基因組的復(fù)制是病毒成功復(fù)制的另一個(gè)關(guān)鍵過程。為了檢驗(yàn)RXR激活是否影響VSV基因組的復(fù)制，VSV感染的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過9順式維甲酸預(yù)處理提取其RNA，負(fù)鏈基因組RNA(VRNA)通過qPCR定量(Simon等2007)RAW264.7細(xì)胞給予9順式維甲酸后其VRNA在感染后兩小時(shí)內(nèi)上升，差異在4小時(shí)候更加明顯，這些結(jié)果表明RXR激活可以提高病毒基因組RNA產(chǎn)生以及病毒蛋白的產(chǎn)生。盡管這兩種過程不是直接相關(guān)的，數(shù)據(jù)表明RXR可能影響病毒周期多種進(jìn)程?？紤]到RXR通過形成同二聚體或異二聚體來(lái)調(diào)節(jié)其靶基因，我們通過激動(dòng)劑與不同的RXR潛在同伴結(jié)合，其中包括VDR、LXR、PPAR- a、PPAR-β 以及 RAR (類視黃醇受體)(Lefebvre 等 2010 ；Roszer 等 2013)。我們發(fā)現(xiàn)只有配體刺激RAR可以促進(jìn)VSV感染，這也暗示RAR與RXR形成異二聚體，是它的潛在同伴。
[0051]實(shí)施例3
[0052]配體激活RXR抑制多種抗病毒基因的表達(dá):
為了研究RXR是如何減弱宿主免疫反應(yīng)并有利于病毒感染，本發(fā)明發(fā)明人對(duì)給予RXR激動(dòng)劑預(yù)先處理組以及巨噬細(xì)胞Poly 1:C轉(zhuǎn)染組進(jìn)行了基因芯片檢測(cè)。結(jié)果表明9順式維甲酸可以抑制多種Poly 1:C誘導(dǎo)基因，其中包括I型干擾素基因(例如IFN1、IFN2、IFN4、IFN5)Isgl5、Ifit3以及Gbp3(如圖3A)考慮到I型干擾素以及其下游的干擾素刺激基因ISGs在抗病毒感染中對(duì)宿主的免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要的作用，RXR介導(dǎo)的對(duì)這些抗病毒基因的抑制可能是宿主對(duì)病毒感染的易感性引起的。為了驗(yàn)證基因數(shù)據(jù)以及證明RXR通過抑制抗病毒基因有利于病毒感染這一假說(shuō)，本發(fā)明發(fā)明人給與RAW264.7細(xì)胞RXR激動(dòng)劑預(yù)處理，或者給予其拮抗劑過夜處理，接著通過Poly I:C轉(zhuǎn)染來(lái)模擬病毒感染刺激細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后2小時(shí)，通過給予9順式維甲酸，配體激活RXR對(duì)主要抗病毒基因IFNl以及Isgl5顯著抑制(如圖3B所示)。通過抗病毒的刺激，次要干擾素誘導(dǎo)基因例如Gbp-1，0as2，IRF7以及Isg20在該組表達(dá)水平也有所降低。(如圖3C所示)給予RXR拮抗劑HX531，一部分但不是全部抗病毒的表達(dá)顯著增加。(如圖3B和3C所示)有趣的是，9順式維甲酸以及HX531處理后給以調(diào)整部分基因的基礎(chǔ)表達(dá)，這說(shuō)明RXR的活化在正常生理狀態(tài)下可能會(huì)抑制抗病毒基因激活(如圖3B和3C所示)在J2病毒持續(xù)存在的骨髓巨噬細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)9順式維甲酸抑制干擾素I以及干擾素4的表達(dá)，然而Poly I:C轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞中，HX531對(duì)干擾素的表達(dá)增加。(如圖9所示)。病毒感染可以直接觸發(fā)主要抗病毒基因(例如干擾素l、Isgl5)的表達(dá)，產(chǎn)生干擾素，并通過自分泌/旁分泌放大抗病毒效應(yīng)。(Sadler和Williams2008)。為了驗(yàn)證RXR是否可以抑制主要抗病毒基因的產(chǎn)生從而抑制干擾素非依賴性下游通路信號(hào)，I型干擾素受體缺乏的骨髓源性巨噬細(xì)胞(IFNar-/-)給予9順式維甲酸以及HX531處理后，Poly