GCTCGTAGT TGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTC ATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTC GAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAA TAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAA AGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGG AACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATC GGACGGGATTCTATAATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGG GGAGTATGGT CGCAAGGCTG AAACTTAAAG AAATTGACGG AAG； 核糖體rRNA 28S基因（28S)序列： GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCTCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTA TTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGTCGGTCAAAGGCCCTCGGAAGGTAACGCCCCTAGGGGCGTCT TATAGCCGAGGGTGCAATGCGACCTGCCTAGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAG CGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC； 擴展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因(PEPG1)序列： TCAAAGTATTTAGTCTCCGTCGATATGTTAATATTGACACGCAGTGTTGTTCTGGGATTGCTAGGCTCAAGGT CTTTGGCCCTCGCCTCTCCCGCTGCCGAACTGGCTGAAGGGGACAGACTCTCCCCTCGCGGATCTGCGTGCAGTTAT TCAGGAGTCAATGGTGCTGCAGCAGCGATAGCTGGAAAGGCAGGTTGCGTCAGTATTACTCTCAATAATGTTGTGGT GCCTGCCGGGACTACGCTGGATTTG； 棒曲霉素合成關(guān)鍵酶異環(huán)氧菌素脫氫酶基因（IDH)序列： CTAATGTATCCTACTGTGCCCGGACCGTCACCAATACTGAGTTGATGACTTCTACCCAACGCTCGCTCAGGAA ATACCGCCCGCGCTGTGGGCACGGCATTCGATGTTGCTAGCAAAGACGCTCTCGTCAAGTGGGTCGAGAGCTCTGCT GAGCGCCTCGGGCGAATTGATGTGATTATAGCCAATGGTGATTGCTTTCCCTGACATATCCTGGTTCGAATGCATAC TAACTAGCCCTAGCGTCGCCAATGCATATGGAAGGCGAGACGGAGCATTGGGAGAGCAGTTTCGCGATCGATGTCAT GGGCTTCGTCGAGTTGGCCAGAGCAGCCACCCCGTACTTAGAAAAATCTCCCCTGGCATCCATCATCGTGCAGAGCT CCTTCATGGGGCGGGAATTCTACCGCTCCCCTCCGGCGGCCTACGGGCCTTGCAAGGCAGCGCAGCTGCAGCATGTC CAGGAGTTGTCCCACTTTTTGGGACCGAAGGGCATCCGGGTCAATGCCATCTCGCCAGGACCAATCCTTTGCAAGGG CGGTCCTTGGGAGCTTTATTCAAAGAGCAACCCGGAATGGGTGGAGGAACAGCGACTGAAGGT。
[0025]測試結(jié)果匯總見表6: 表6實驗室定值結(jié)果
以上內(nèi)容是結(jié)合優(yōu)選技術(shù)方案對本發(fā)明所做的進一步詳細說明，不能認定發(fā)明的具體 實施僅限于這些說明。對本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的構(gòu) 思的前提下，還可以做出簡單的推演及替換，都應(yīng)當視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種擴展青霉核酸序列定性標準樣品，其特征在于:所述擴展青霉核酸序列定性標 準樣品包含的序列為： 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因（ITS)序列：棒曲霉素合成關(guān)鍵酶異環(huán)氧菌素脫氨酶基因（IDH)序列：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種擴展青霉核酸序列定性標準樣品，其特征在于:所述擴展 青霉核酸序列定性標準樣品的指標如下表所示： 表1擴展青霉核酸序列標準樣品指標與GeneBank中的序列比對，設(shè)定與目標基因覆蓋率大于90%條件下進行。3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴展青霉核酸序列定性標準樣品的制備方法，其特征在 于:包括W下步驟： 第一步:總DNA提取： 將擴展青霉（Penicillium expansum)CICC 40356菌株接種在真菌分離純化培養(yǎng)基 (PDA)培養(yǎng)基平板上，28 Γ培養(yǎng)至菌株長滿整個平板，待用； 收集對數(shù)期菌體至研鉢中，加液氮充分研磨后，用真菌DNA試劑盒(D3390-01)(0MEGA Rmgal DM Mini Kit (D3390-01))進行DM提??； 第二步:特異性PCR擴增： 特異性PCR擴增的反應(yīng)體系為50化，其中l(wèi)OXbuffer 5化、dNTP化L、Mgh化L、引物各2 化、Taq酶化L、模板化L，之后用雙蒸水補足到50化； ITS序列片段、18S序列片段及28S序列片段PCR擴增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min， 94°C 變性 5〇3,50°(：復(fù)性1111111，72°(：延伸11111113〇3，進行35個循環(huán)，最后72°(：終延伸1〇111111，41： 保溫； PEPG1序列片段及IDH序列片段PCR擴增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性50s， 62°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin30s，進行35個循環(huán)，最后72°C終延伸10min，4°C保溫； 各引物序列見表2: 表2各引物序列第Ξ步:PCR擴增產(chǎn)物純化： PCR擴增產(chǎn)物純化采用PCR純化試劑盒（D64920-1)(0MEGA切cle-Pure Kit(D64920- 1))進行； 第四步:序列測定； 將上述PCR擴增產(chǎn)物送外公司進行測序； 第五步:質(zhì)粒制備： 將PCR擴增后獲得的擴展青霉菌基因、棒曲霉素基因、ITS基因、18S rRNA基因及28S rRNA目的片段回收后，連接至PUC18質(zhì)粒載體，通過篩選鑒定獲得具有插入片段的克隆，質(zhì) 粒標準樣品再經(jīng)有資質(zhì)的測序公司進行測序比對確認，具體步驟如下： (1) 將第二步中PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒（TaKaRa Mini肥ST Agarose Gel DM Extraction Kit，TaKaRa)純化，在Τ4 DM連接酶作用下和Τ載體（TaKafoi的pMDlS-T Vector，TaKaRa)16°C連接過夜，連接體系如下： T載體 化1 PCR片段 化L 10XT4 buffer lyL Τ4 DM連接酶 lyL ; (2) 轉(zhuǎn)化 取上述連接液扣L轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DH5a化學(xué)感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C熱激 2min，置冰上5min，加入 1ml LB培養(yǎng)液37°C 搖床45min，離屯、5000;rpm，l-5min，最后取 100- 150化混合液均勻涂布在含有l(wèi)(K)ng/ml抗生素的LB平板上，將平板在37°C倒置培養(yǎng)過夜，挑 取陽性克隆菌落轉(zhuǎn)劃到另一塊含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并對之進行編號，37Γ倒 置培養(yǎng)過夜； (3) 菌落原位PCR 挑取轉(zhuǎn)劃后長出的陽性克隆菌落，加入化L細菌DNA提取液破細胞，將細菌裂解液作為 PCR模板，其他PCR組分及PCR條件同第二步，后將PCR產(chǎn)物在2%凝膠上進行電泳分析； (4) 采用質(zhì)粒抽提試劑盒(Plasmid Midi Preparation Kit,QIAGEN)抽提質(zhì)粒，收集質(zhì) 粒，測濃度，電泳檢測，即得擴展青霉核酸序列定性標準樣品。4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的擴展青霉核酸序列定性標準樣品制備方法，其特征在于:所 述擴展青霉核酸序列定性標準樣品包含擴展青霉菌特異性基因多聚半乳糖醒酸酶基因質(zhì) 粒、棒曲霉素毒素棒曲霉素合成關(guān)鍵酶異環(huán)氧菌素脫氨酶基因質(zhì)粒、ITS基因質(zhì)粒、18S基因 質(zhì)粒及28S基因質(zhì)粒。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種擴展青霉核酸序列定性標準樣品及其制備方法。采集對數(shù)生長期的擴展青霉，提取總DNA，進行特異性PCR擴增測序后，對質(zhì)粒進行制備。本發(fā)明方法制備出的核酸序列標準樣品不再具有生物活性，不存在生物污染和傳染的問題，解決了分子生物學(xué)陽性對照的來源問題，且樣品穩(wěn)定，無污染，易保存。本發(fā)明根據(jù)擴展青霉具有分類學(xué)意義的核酸序列技術(shù)指標，解決擴展青霉核酸序列標準樣品溯源參照系與參照指標問題，并應(yīng)用于本標準樣品的定值分析中，獲得具有真正溯源意義的擴展青霉核酸序列標準樣品，在國內(nèi)核酸序列分類定級標準樣品的研制方面具有重要意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/63, C12Q1/04, C12N15/10
【公開號】CN105567848
【申請?zhí)枴緾N201610099567
【發(fā)明人】劉淑艷, 蔣丹, 孫曉飛, 顏懷玉, 鄭江
【申請人】劉淑艷, 蔣丹, 孫曉飛, 顏懷玉
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月23日