擴展青霉核酸序列定性標準樣品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種擴展青霉核酸序列定性標準樣品及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 世界糧農(nóng)組織(FA0)報告，全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受真菌及其真菌毒素污 染，約有2%的農(nóng)作物因污染嚴重而失去營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，由此估算，全球每年因真菌 毒素污染而造成的直接及間接損失將可能達到數(shù)百億美元。
[0004] 棒曲霉素(？3七以1^11)又稱展青霉素，化學(xué)名稱為4-羥基-4!1呋[3,2(3]吡喃-2(6!〇-酮，是青霉屬（PeniciIlium)、曲霉屬(Aspergillus)和絲衣霉屬（Byssochlamys)等多種真 菌的一種次級代謝產(chǎn)物。20世紀50年代，人們發(fā)現(xiàn)棒曲霉素不僅大量污染糧食飼料，而且 對蘋果及其制品的污染嚴重。研究已證明，棒曲霉素是一種可引起動物致畸、致癌及致突變 毒素，人體攝入棒曲霉素后會出現(xiàn)嘔吐和胃刺激等不良癥狀，世界衛(wèi)生組織嚴格規(guī)定食品 中棒曲霉素量<50yg/L。我國GB2761-2011中規(guī)定水果及其制品、飲料類和酒類中棒曲霉素 的限量為50yg/kg。棒曲霉素廣泛存在于多種食品加工原料中，尤其在濃縮果汁加工原料的 產(chǎn)品中最為突出。棒曲霉素的傳統(tǒng)檢測主要是培養(yǎng)法，耗時長，無法實現(xiàn)快速檢測的目的， 目前，全球還沒有對棒曲霉素的現(xiàn)場、快速、實時的檢測方法，都還應(yīng)用液相色譜法來檢測， 其需要的時間長，對現(xiàn)場控制沒有時效性。
[0005] 真菌毒素是困擾食品安全的大問題，但是目前針對真菌毒素檢測的化學(xué)方法無法 檢測還未產(chǎn)生毒素但攜帶毒素基因的潛在產(chǎn)毒真菌，而分子生物學(xué)方法則可以快速篩選， 預(yù)先排除存在的產(chǎn)毒真菌，從而避免糧食、食品的大面積的污染。但是由于真菌孢子易于飄 散，極易污染且難以消除等特性，需要特殊的操作空間，一些實驗室不具備相應(yīng)的工作條 件，檢測工作難以完成。
[0006] 近年來PCR技術(shù)在微生物的檢測方面具有明顯優(yōu)勢。ITS(Internal Transcribed Spacer):內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是真菌核糖體RNA(rRNA)基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分。用于真菌鑒定的 ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S和ITS24DNA上的5 .8S、18S和28S rRNA基因有極大的保 守性，即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進 化過程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異，在絕大多數(shù)的真核生物中 表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個種都能在ITS序列上 表現(xiàn)出差異，顯示最近的進化特征。研究表明，ITS片段的進化速率是18 S rDNA的10 倍，這就是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎(chǔ)。ITS1和ITS2是中度保守 區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯。這種特點使ITS適合于 真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。由 于ITS的序列分析能實質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異，同時ITS序列 片段較小、易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究 中。ITS的序列分析還有效地解決真菌應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征進行分類所引起的紛爭，彌補了傳 統(tǒng)分類上的一些不足。
[0007] 另外，目前已研制的分類定級國家標準樣品多數(shù)溯源至相應(yīng)的文字標準，生物類 定性標準樣品多數(shù)溯源至公認的測試方法，部分國家標準樣品沒有溯源性的描述。對2010 年~2015年批準的146項分類定級國家標準樣品溯源性描述的調(diào)查表明：無溯源性描述內(nèi) 容的35項，溯源至測試方法標準的102項，溯源至核酸序列的22項，溯源至產(chǎn)品標準的5項， 溯源至計量基準的1項，溯源至權(quán)威專家的1項。分類定級國家標準樣品溯源性描述的狀況 說明人們對這類標準樣品的溯源性認識和理解上處于比較混亂的階段，還沒有一個統(tǒng)一的 規(guī)范。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種生物和產(chǎn)毒信息明確的擴展青霉核 酸序列定性標準樣品制備方法，同時采用標準物質(zhì)分類定級理論，建立擴展青霉核酸序列 定性標準樣品定值溯源參照系與參照指標。本發(fā)明的另一目的是提供一種擴展青霉核酸序 列定性標準樣品的制備方法。
[0009] 本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種擴展青霉核酸序列定性標準樣 品，其特征在于:所述擴展青霉核酸序列定性標準樣品包含的序列為： 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因（ITS)序列： TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTAT TTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTTACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAG ACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCT TGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCT TTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTT GTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCGATCTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGC GTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCT CGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA； 核糖體rRNA 18S基因（18S)序列： GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAACTTGTACTGTGAAACTGCGA ATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATA CATGCTAAAAACCCCGACTTCAGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGA ATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGAT GGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAA CGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAC TGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCA AGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGT TGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTC ATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTC GAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAA TAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAA AGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGG AACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATC GGACGGGATTCTATAATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGG GGAGTATGGT CGCAAGGCTG AAACTTAAAG AAATTGACGG AAG； 核糖體rRNA 28S基因（28S)序列： GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCTCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTA TTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGTCGGTCAAAGGCCCTCGGAAGGTAACGCCCCTAGGGGCGTCT TATAGCCGAGGGTGCAATGCGACCTGCCTAGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAG CGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC； 擴展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因 (PEPG1)序列： TCAAAGTATTTAGTCTCCGTCGATATGTTAATATTGACACGCAGTGTTGTTCTGGGATTGCTAGGCTCAAGGT CTTTGGCCCTCGCCTCTCCCGCTGCCGAACTGGCTGAAGGGGACAGACTCTCCCCTCGCGGATCTGCGTGCAGTTAT TCAGGAG