一種治療腎癌的倍半萜化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術領域，具體涉及從干燥的獨活中分離得到的一種新的倍半萜 類化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 獨活為傘形科植物重齒毛當歸Angel ica pubescens Maxim, f.biserrata Shan et Yuan的干燥根。春初苗剛發(fā)芽或秋末莖葉枯萎時采挖，除去須根及泥沙，烘至半干，堆置 2~3天，發(fā)軟后再烘至全干。性微溫，味辛、苦，歸腎、膀胱經(jīng)。有祛風除濕、通痹止痛、解表之 功效，臨床上主要用于治療風寒濕痹、腰膝疼痛、風寒挾濕表證、少陰伏風頭痛等證。始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，言其"味苦，平。主風寒所擊，金瘡止痛，奔豚，癇痙，女子疝瘕。月艮 輕身耐老"。主產(chǎn)于湖北、四川、陜西、浙江等地，又稱川獨活、資丘獨活、巴東獨活、恩施獨 活、肉獨活、浙獨活、績獨活、香獨活等，以根條粗壯，油潤，質軟，香氣濃者為佳。
[0003] 目前從各種不同品種獨活中已分離出香豆素、萜類、揮發(fā)油、有機酸和糖類等多種 化學成分。香豆素是獨活重要的活性成分。香豆素(Coumarin)是具有苯駢α-吡喃酮結構的 一類化合物?？煽醋魇琼樖洁徚u基桂皮酸脫水而形成的內酷，絕大多數(shù)在C 7位有羥基或烴 基，具有芳香氣味。
[0004] 現(xiàn)代研究證實，獨活具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集、抗氧化、抗衰老、抗腫 瘤、抗血管生成等藥理作用。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的獨活中分離得到的一種新的倍半萜類化合物， 含其的藥物組合物及其制備方法和應用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結構式的化合物(I):
[0008]
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將干燥的獨活粉碎，用80~ 90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇 取物用大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個柱體積，再用75%乙醇洗脫8個柱體積，收集 75%洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫濃縮物用正相 硅膠分離，依次用體積比為65:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分； (d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1、8:1和5:1的二氯甲烷_ 甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用 體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到純的化合物(I)。
[0010] 進一步地，步驟(a)中，用85%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0012] 藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(I)和藥學上可接受的載體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療腎癌的藥物中的應用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質體或乳劑等。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結構式；
[0019] 圖2為化合物（I)計算E⑶和實驗E⑶圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。
[0021 ] 主要材料、試劑來源及儀器類型：
[0022]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限 公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0023]實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0024] (a)將干燥的獨活(8kg)粉碎，用85 %乙醇熱回流提取(30L X 3次），合并提取液，濃 縮至無醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次)和水飽和的正丁醇(6L X 3 次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（375g)和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個柱體積，再用75%乙醇洗脫8個 柱體積，收集75 %洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫濃縮物（129g);(c)步驟(b)中75 %乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為65:1 (8個柱體積）、30:1 (8個柱體積）、15:1 (8 個柱體積)和8:1(10個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至Ij4個組分；（d)步驟(c)中組分 4(27g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為12:1 (8個柱體積）、8:1 (10個柱體積)和5:1 (8個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2(15g)用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個 柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I) (40mg)。
[0025] 結構確證:無色油狀物;冊43頂3顯示[1+似]+為111/2 259.1720，結合核磁特征可 得分子式為C15H24〇2，不飽和度為4。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ( ΡΡπι，DMS〇-d6，400MHz):H-1 (2 · 19， m)，H-2(1.93，m)，H-2(2.01，m)，H-3(1.38，m)，H-3(1.56，m)，H-5(3.18，m)，H-6(1.54，m)，H-6(1.67，ddd，J=12.7，11.0,2.4)，H-8(1.93，m)，H-8(2.02，m)，H-9(1.49，m)，H-9(1.55，m)， H-10(5.02，t，J=6.5)，H-12(1.54，s)，H-13(1.56，s)，H-14(4.60，s)，H-14(4.69，s)，H-15 (3.24，(1，了=11.1)，!1-15(3.47，111) ;核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。(卯111，0130-(16，1001抱）：37.4(〇1， 1-C)，27.6(CH2,2-C)，29.3(CH2,3-C)，68.2(C，4-C)，58.7(CH，5-C)，35.1(CH2,6-C)，155.2 (C，7-C)，35.6(CH2,8-C)，27.0(CH2,9-C)，125.1(CH，10-C)，131.8(C，n-C)，17.6(CH 3，12-C)，25 · 4(CH3，13-C)，107 · 5(CH2，14-C)，68 · 9(CH2，15-C);碳原子標記參見圖 1 ,Η-NMR譜顯 示了兩個甲基信號[SH1.54(3H，s，H-12)和1.56(3!1，8，!1-13)]，一個烯屬亞甲基[6!14.60(8， H-14)和4.69(8，!1-14)]，一個含氧亞甲基[5!13.24((1，了=11.1!^，!1-15)和3.47(111，!1-15)]， 一個烯屬次甲基質子信號[陽5.02(^ = 6.5抱，!1-10)]，一個含氧次甲基信號[6!13.18(111， H-5)L13C-NMR譜顯示了 15個共振碳信號，包括兩個甲基，七個亞甲基(一個烯屬亞甲基，一 個含氧亞甲基），三個次甲基(一個烯屬次甲基，一個含氧次甲基），以及三個季碳(兩個烯烴 季碳，一個含氧季碳）。HMBC譜中，H2-15 (δΗ3 · 24，3 · 47)，與C-3 (SC29 · 3)，C-4 (SC68 · 2)和C-5 0058.7);!1-5(3!13.18)與(：-1(3037.4)，(：-3(3029.3)，(：-4(3068.2)和(：-15(3068.9) ;!1-10 0!15.02)與(：-8(5035.6)，(：-120(：17.6)和(：-130025.4) ;以及16-12(5!11.54)與(：-10(3 C125.1)和C-13(SC25.4)的相關性表明C-4和C-5為環(huán)氧碳，C-11連有兩個甲基。R0ESY譜中， H-5與H-15和Η-6α，Η_15與Η_3α和H-5,以及Η_3α與H-15的相關性表明H-5和H-15為α構型；H-6β與Η-1的交叉峰表明Η-1為β構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻關于相關 類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值 與實驗值基本一致(圖2)。
[0026]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗
[0027] 一、材料和儀器
[0028] 人腎癌RC-2細胞株購于ATCC細胞庫(美國）。分析純蔗糖購于國藥集團化學試劑公 司。重水(D20)購于青島騰龍微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺單體、1'冊61120購 于重慶醫(yī)科大學基礎研究所實驗室。小牛血清、RPMI-1640購于美國Gibco公司。Centriplus 離心超濾管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（100kD)、PVDF膜購于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海安亭科學儀器廠。5 X SDS-PAGE蛋白質 上樣緩沖液、BeyoECL熒光檢測試劑、考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250購于碧云天生物技 術研究所?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人批？70單克隆抗體、兔抗人 ICAM-1單克隆抗體、兔抗人G250多克隆抗體購于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗體武 漢博士德生物有限公司。
[0029] 超凈工作臺（蘇州華新空調凈化有限公司），自動平衡離心機(上海醫(yī)用分析儀器 廠）