體物質(zhì) 相互作用的實(shí)時解析實(shí)驗(yàn)法"，Springer-Verlag東京，1998年，41頁）。親和常數(shù)是用結(jié)合速 率常數(shù)化。η)除W解離速率常數(shù)化。ff)得到的值化4=心。/^山因此，在結(jié)合速率常數(shù)變?yōu)楦?大的值時、解離速率常數(shù)變?yōu)楦〉闹禃r，親和常數(shù)變大。特別是解離速率常數(shù)是表示相互 作用的2個分子的分離容易性的指標(biāo)，所W可認(rèn)為解離速率常數(shù)小時，固定化有本發(fā)明膚的 親和分離基質(zhì)的化b片段的保持性能高。因此，對于具有導(dǎo)入了本發(fā)明的突變的序列的膚而 言，與具有導(dǎo)入突變前的序列的膚相比，可優(yōu)選使用解離速率常數(shù)化。ff)變?yōu)?/2W下的膚， 可更優(yōu)選使用變?yōu)闉?/3 W下，進(jìn)而可更優(yōu)選變?yōu)?/4W下，進(jìn)而可更優(yōu)選變?yōu)?/5 W下，特 別可優(yōu)選變?yōu)?/10W下的膚。
[0069] 本發(fā)明的突變體和化b片段的親和常數(shù)可W利用Biacore系統(tǒng)，將化b片段固定化 在傳感器忍片上，在溫度25°C、pH7.4的條件下，流路添加本發(fā)明突變體的實(shí)驗(yàn)體系計(jì)算出。 對于具有導(dǎo)入了本發(fā)明的突變的序列的膚而言，可優(yōu)選使用親和常數(shù)化A)與具有導(dǎo)入該突 變前的序列的膚相比提高2倍W上的膚，可更優(yōu)選提高3倍W上，更優(yōu)選提高5倍W上，更優(yōu) 選提高6倍W上，更優(yōu)選提高7倍W上，更優(yōu)選提高10倍W上，更優(yōu)選提高20倍W上，特別優(yōu) 選提高了50倍W上的膚。
[0070] 本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚(2)為具有上述化b區(qū)域結(jié)合性膚（1)規(guī)定的氨基酸序 列中除了上述第13位、第19位、第30位和第33位W外的區(qū)域中缺失、置換和/或添加了 1個或 多個氨基酸殘基的氨基酸序列、并且與免疫球蛋白的化b區(qū)域的結(jié)合力高于具有序列號1的 氨基酸序列的膚的化b區(qū)域結(jié)合性膚。
[0071] 對于"缺失、置換和/或添加了 1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列"中的"1個或多 個"的范圍只要具有缺失等的化b區(qū)域結(jié)合性膚具有與IgG的化b區(qū)域高的結(jié)合力則沒有特 別限定。前述"1個或多個"的范圍，例如可W為1個W上且20個W下，優(yōu)選為1個W上且15個 W下，更優(yōu)選為1個W上且10個W下，更優(yōu)選為1個W上且7個W下，甚至優(yōu)選為1個W上且5 個W下，特別優(yōu)選為1個W上且3個W下，1個W上且2個W下，或1個左右。
[0072] 在本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚(2)的氨基酸序列中，氨基酸殘基的缺失、置換和/或 添加的位點(diǎn)只要除了 Fab區(qū)域結(jié)合性膚（1)規(guī)定的第13位、第19位、第30位和第33位W外則 沒有特別限制。例如優(yōu)選為選自第2位、第10位、第15位、第18位、第21位、第22位、第23位、第 24位、第25位、第27位、第28位、第31位、第32位、第35位、第36位、第39位、第40位、第42位、第 45位、第47位和第48位的1個W上的位點(diǎn)，運(yùn)些位點(diǎn)特別是作為被置換的位點(diǎn)而優(yōu)選。
[0073] 對于置換上述位點(diǎn)的氨基酸殘基的氨基酸的種類沒有特別限定，例如，作為置換 的氨基酸，第2位優(yōu)選為Arg、第10位優(yōu)選為Arg、第15位優(yōu)選為Gin和化r等中性的極性氨基 酸類，第18位優(yōu)選為Ala、第21位優(yōu)選為I le、Ala或Asp、第22位優(yōu)選為Asn或Glu、第23位優(yōu)選 為化r或Asp、第24位優(yōu)選為化r、第25位優(yōu)選為Ser或Met、第27位優(yōu)選為Asp或Gly、第28位優(yōu) 選為Arg、Asn或lie、第31位優(yōu)選為Arg、第32位優(yōu)選為Arg、第35位優(yōu)選為化e、Tyr等芳香族 氨基酸類，第36位優(yōu)選為Gly、第39位優(yōu)選為Leu或I le、第40位優(yōu)選為化1或Glu、第42位優(yōu)選 為Leu、Val或Gin、第45位優(yōu)選為化e、第47位優(yōu)選為化3、4311、413、617或了71'、第48位優(yōu)選為 化r。特別是，第2位優(yōu)選為Arg、第10位優(yōu)選為Arg、第15位優(yōu)選為中性極性氨基酸類，第18位 優(yōu)選為Ala、第21位優(yōu)選為Ala或Asp、第39位優(yōu)選為Leu或11 e、第47位優(yōu)選為Ala。
[0074] 除此W外，作為被置換的位點(diǎn)也可舉出，作為在野生型SpG-β、已知的SpG-β突變體 之間氨基酸的種類不同的位點(diǎn)的選自第6位、第7位、第24位、第28位、第29位、第31位、第35 位、第40位、第42位和第47位1個W上的位點(diǎn)。
[007引另外，本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚(2)的氨基酸序列中，作為氨基酸殘基的缺失、置 換和/或添加的位點(diǎn)可舉出N末端和/或C末端。運(yùn)些位點(diǎn)特別地是作為缺失和/或添加的位 點(diǎn)而優(yōu)選。
[0076]本發(fā)明的Fab區(qū)域結(jié)合性膚(2)與IgG的Fab區(qū)域的結(jié)合力可與上述Fa啦域結(jié)合性 膚（1)相同地進(jìn)行測定。
[OOW]本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚(3)為具有相對于所述（1)規(guī)定的氨基酸序列具有80% W上的序列一致性的氨基酸序列、并且與免疫球蛋白的化b區(qū)域的結(jié)合力高于具有序列號1 的氨基酸序列的膚的化b區(qū)域結(jié)合性膚(其中，上述(1)規(guī)定的氨基酸序列中的選自第13位、 第19位、第30位和第33位的1個W上位點(diǎn)的氨基酸殘基的置換在(3)中不進(jìn)一步突變）。
[007引作為上述序列一致性，優(yōu)選為85 % W上，更優(yōu)選為90 上，95 上，98 上 或99 % W上，特別優(yōu)選為99.5 % W上。
[0079] 上述序列一致性與Fab區(qū)域結(jié)合性膚（1)中說明的相同，可使用作為氨基酸序列多 重比對用程序的ClustaKht化：//www. clustal .0巧/omega/)等進(jìn)行測定。另外，本發(fā)明的 Fab區(qū)域結(jié)合性膚(3)與IgG的化b區(qū)域的結(jié)合力也可與上述化b區(qū)域結(jié)合性膚（1)相同地進(jìn) 行測定。
[0080] SpG是包含W串聯(lián)方式排列的2個或3個免疫球蛋白結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。作為 實(shí)施方式之一，本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚也可W為連接了 2個W上，優(yōu)選為3個W上，更優(yōu) 選為4個W上，更優(yōu)選為5個W上的作為單體或單結(jié)構(gòu)域的該化b區(qū)域結(jié)合性膚的多個結(jié)構(gòu) 域的多聚體。作為連接的結(jié)構(gòu)域數(shù)的上限為10個W下，優(yōu)選為8個W下，更優(yōu)選為6個W下。 運(yùn)些多聚體可為作為單一的Fab區(qū)域結(jié)合性膚的連接體的同源雙體、同源Ξ體等同聚體，或 也可為作為多種化b區(qū)域結(jié)合性膚的連接體的異源雙體、異源Ξ體等異聚體。
[0081] 作為通過本發(fā)明得到的單體膚的連接方法，可舉出由1個或多個氨基酸殘基連接 的方法、未夾雜氨基酸殘基而直接連接的方法，但并不限定于運(yùn)些方法。對于連接的氨基酸 殘基數(shù)沒有特別限制，優(yōu)選為20殘基W下，更優(yōu)選為15殘基W下，進(jìn)而更優(yōu)選為10殘基W 下，進(jìn)而更優(yōu)選為5殘基W下，進(jìn)而更優(yōu)選為2殘基W下。優(yōu)選的是利用連接于野生型SpG的0 1和的之間的序列即可。另外，從其他的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選為不使單體膚的Ξ維立體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生 不穩(wěn)定化的方法。
[0082] 另外，作為實(shí)施方式之一，可列舉出特征在于W本發(fā)明得到的化b區(qū)域結(jié)合性膚或 連接了 2個W上該膚的膚多聚體作為1個構(gòu)成成分，與功能不同的其他膚融合而成的融合 膚。作為融合膚的例子，可舉出融合了白蛋白、GST(谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶)的膚作為例子，但并 不限定于此。另外，融合了DNA適配體等核酸、抗生素等藥物、PEG(聚乙二醇）等高分子的情 況下，只要是利用了本發(fā)明中得到的膚的有用性的物質(zhì)也包含在本發(fā)明中。
[0083] 作為1個實(shí)施方式本發(fā)明也包括:利用上述的本發(fā)明膚作為特征在于具有與IgG及 其片段、特別是與化b區(qū)域的親和性的親和配體。相同地，作為1個實(shí)施方式也包含:特征在 于將該配體固定化于水不溶性載體的親和分離基質(zhì)。此處，"親和配體"是指如下術(shù)語:基于 W抗原與抗體的結(jié)合為代表的特異的分子間的親和力，從某分子的集合中選擇性地捕集 (結(jié)合）目標(biāo)分子的物質(zhì)、官能團(tuán)，本發(fā)明中是指與IgG進(jìn)行特異性結(jié)合的膚。本發(fā)明中，簡單 標(biāo)記為"配體"時也與"親和配體"同義。
[0084] 作為用于本發(fā)明的水不溶性載體，可舉出玻璃珠、硅膠等無機(jī)載體；交聯(lián)聚乙締 醇、交聯(lián)聚丙締酸醋、交聯(lián)聚丙締酷胺、交聯(lián)聚苯乙締等合成高分子;包括結(jié)晶纖維素、交聯(lián) 纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖等多糖類的有機(jī)載體;進(jìn)而通過運(yùn)些組合而得到的有機(jī)-有機(jī)、有機(jī)-無機(jī)等復(fù)合載體等。作為市售品，可示例出作為多孔纖維素凝膠的GCL2000、締 丙基葡聚糖與亞甲基雙丙締酷胺通過共價(jià)鍵而交聯(lián)的s邱hac巧1 S-1000、作為丙締酸醋系 的載體的Toyopearl、作為瓊脂糖系的交聯(lián)載體的S邱]larose CL4BW及作為纖維素系的交 聯(lián)載體的Cellufine等。其中，本發(fā)明中的水不溶性載體并不僅限定于所例示的運(yùn)些載體。
[0085] 另外，用于本發(fā)明的水不溶性載體從本親和分離基質(zhì)的使用目的和方法來看，優(yōu) 選為表面積大，具有多個適當(dāng)大小的細(xì)孔的多孔物質(zhì)。作為載體的形態(tài)，串珠狀、整塊狀、纖 維狀、膜狀(含有中空纖維)等均可，可選擇任意的形態(tài)。
[0086] 對于配體的固定化方法而言，例如也可通過利用了存在于配體的氨基、簇基或琉 基的現(xiàn)有的禪聯(lián)方法與載體結(jié)合。作為禪聯(lián)方法，可舉出使漠化氯、環(huán)氧氯丙烷、二縮水甘 油酸、對甲苯橫酷氯、Ξ氣乙燒橫酷氯、阱或高艦酸鋼等與載體反應(yīng)并活化載體、或者在載 體表面導(dǎo)入反應(yīng)性官能團(tuán)，與作為配體進(jìn)行固定化的化合物進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)而進(jìn)行固定化的 方法；另外，還可舉出利用在載體和作為配體固定化的化合物所存在的體系中加入如碳二 亞胺的縮合試劑或如戊二醒那樣在分子中具有多個官能團(tuán)的試劑來進(jìn)行縮合、交聯(lián)的固定 化方法。
[0087] 另外，也可在配體與載體之間導(dǎo)入包括多個原子的間隔子分子，也可將配體直接 固定化于載體。因此，為了進(jìn)行固定化，也可對本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚進(jìn)行化學(xué)修飾，或 也可加入有利于固定化的氨基酸殘基。作為有利于固定化的氨基酸，可舉出在側(cè)鏈具有有 利于固定化的化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)的氨基酸，例如可舉出側(cè)鏈上含有氨基的Lys、側(cè)鏈上含有 琉基的切S。本發(fā)明的本質(zhì)在于:本發(fā)明中對膚賦予的化b區(qū)域結(jié)合性在作為配體對該膚進(jìn) 行固定化的基質(zhì)中也相同地被賦予，為了固定化，無論W何種方式進(jìn)行修飾?改變均包含 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0088] 可利用本發(fā)明的親和分離基質(zhì)并通過親和柱層析純化法對含IgG的化b區(qū)域的膚 進(jìn)行分離純化。含有運(yùn)些IgG的化b區(qū)域的膚的純化法可通過WigG的親和柱層析純化法例 如利用了 SpA親和分離基質(zhì)的純化法為準(zhǔn)的步驟來完成(非專利文獻(xiàn)1)。即，在制備包含含 有IgG的化b區(qū)域的膚的緩沖液(抑為中性附近)后，使該溶液通過填充了本發(fā)明的親和分離 基質(zhì)的親和層析柱，吸附含IgG的化b區(qū)域的膚。接著，使純粹的緩沖液適量通過親和層析 柱，清洗層析柱內(nèi)部。此時，所期望的含IgG的化b區(qū)域的膚被吸附在層析柱內(nèi)的本發(fā)明的親 和分離基質(zhì)上。而且，在添加該樣品的工序至清洗基質(zhì)的工序中，將本發(fā)明中得到的膚作為 配體固定化了親和分離基質(zhì)具有優(yōu)異的保持吸附作為目標(biāo)的含IgG的化b區(qū)域的膚的性能。 接著，將調(diào)整為適合的抑的酸性緩沖液(也有含有促進(jìn)從該基質(zhì)的解離的物質(zhì)的情況)在層 析柱內(nèi)通液，通過洗脫所期望的