Fab區(qū)域結(jié)合性肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及對(duì)于IgG的化b區(qū)域的結(jié)合能力極其優(yōu)異的化b區(qū)域結(jié)合性膚、具有該 膚作為配體的親和分離基質(zhì)、使用該親和分離基質(zhì)的含化b區(qū)域蛋白質(zhì)的制造方法、編碼該 膚的DNA、包含該DNA的載體、W及利用該載體而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為蛋白質(zhì)的重要的功能之一，可舉出與特定的分子進(jìn)行特異性結(jié)合的功能。該 功能在生物體內(nèi)的免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。也正廣泛地進(jìn)行著將該功能用 于有用物質(zhì)的分離純化的技術(shù)開發(fā)。作為實(shí)際利用于產(chǎn)業(yè)上的一個(gè)例子，可舉出為了從動(dòng) 物細(xì)胞培養(yǎng)物中一次W高純度純化(捕獲)抗體藥物所利用的蛋白A親和分離基質(zhì)下有 時(shí)將蛋白A省略為"SpA")(非專利文獻(xiàn)1、2)。
[0003] 作為抗體藥物被開發(fā)的基本上為單克隆抗體，使用重組培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)等進(jìn)行大量 生產(chǎn)。"單克隆抗體"是指通過(guò)來(lái)自單一的抗體生成細(xì)胞的克隆而得到的抗體。目前市場(chǎng)上 的抗體藥物的大部分是分子結(jié)構(gòu)為免疫球蛋白G(IgG)亞類。另外，對(duì)包括具有對(duì)免疫球蛋 白進(jìn)行片段化后的分子結(jié)構(gòu)的抗體衍生物(片段抗體）的抗體藥物也正廣泛地進(jìn)行臨床開 發(fā)，多個(gè)包括免疫球蛋白的化b片段的抗體藥物已上市(非專利文獻(xiàn)3)。
[0004] 抗體藥物制造工序中的初期純化工序中使用了前述的SpA親和分離基質(zhì)。然而， SpA是基本上與IgG的化區(qū)域進(jìn)行特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。因此，對(duì)于不含化區(qū)域的片段抗體 無(wú)法利用SpA親和分離基質(zhì)進(jìn)行捕獲。因此，從抗體藥物純化工藝的平臺(tái)化的觀點(diǎn)考慮，對(duì) 于能夠?qū)Σ缓琁gG的Fc區(qū)域的片段抗體進(jìn)行捕獲的親和分離基質(zhì)的產(chǎn)業(yè)需求高。
[0005] 已知，已有多個(gè)與除IgG的化區(qū)域W外結(jié)合的蛋白質(zhì)（非專利文獻(xiàn)4)。然而將運(yùn)樣 的蛋白質(zhì)作為配體的親和分離基質(zhì)事實(shí)上并沒(méi)有與SpA親和分離基質(zhì)相同地為了進(jìn)行抗體 藥物的純化而被標(biāo)準(zhǔn)地產(chǎn)業(yè)利用。
[0006]例如，從G組的鏈球菌(Streptococcus sp.)中發(fā)現(xiàn)的被稱為G蛋白的蛋白質(zhì)（W下 有時(shí)將G蛋白簡(jiǎn)稱為"SpG")具有與IgG結(jié)合的性質(zhì)，也有將該SpG作為配體進(jìn)行固定化后的 SpG 親和分離基質(zhì)產(chǎn)品（GE Healthcare 社制，產(chǎn)品名 "Protein-G Sepharose 4 hst Flow",專利文獻(xiàn)1)。已知，SpG與IgG的化區(qū)域強(qiáng)烈地結(jié)合，但也與化b區(qū)域較弱地結(jié)合(非專 利文獻(xiàn)4、5)。然而，由于與SpG的Fab區(qū)域的結(jié)合力較弱，所W可認(rèn)為SpG親和分離基質(zhì)產(chǎn)品 的不含化區(qū)域而僅含F(xiàn)ab區(qū)域的片段抗體的保持性能低。因此，也嘗試了通過(guò)在SpG中導(dǎo)入 突變來(lái)提高與Fab區(qū)域的結(jié)合力(專利文獻(xiàn)2)。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) [000引專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1:日本特表昭63-503032號(hào)公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)2:日本特開2009-195184號(hào)公報(bào)
[0011] 非專利文獻(xiàn)
[0012] 非專利文獻(xiàn)l:H〇ber S.等 J.C虹〇111曰如邑'.8,2007,848卷，40-47頁(yè)
[0013] 非專利文獻(xiàn)2:化址1日 A.A.等，Trends Biotechnol. ,2010,28卷，253-261 頁(yè)
[0014] 非專利文獻(xiàn)3:化Ison A.N.等，Nat.Biotechnol. ,2009,27卷，331-337頁(yè)
[001 引 非專利文獻(xiàn)4:8011￥61口.]\,1]11:.]\11111]111]1〇地曰1'1]1曰。.，1994,16卷,419-424頁(yè)
[0016] 非專利文獻(xiàn)5:Derrick J.P.，NaUire, 1992,359卷，752-754頁(yè)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0018] 如上所述，一直W來(lái)，蛋白A(SpA)作為用于吸附抗體并進(jìn)行純化的親和配體而被 實(shí)用化，然而SpA表現(xiàn)出僅與IgG的Fc區(qū)域特異的親和性。但是近年來(lái)，開發(fā)了將抗體的片段 作為藥物利用的技術(shù)，因而就尋求對(duì)IgG的化b區(qū)域也具有親和性的配體。作為不僅對(duì)化區(qū) 域而且對(duì)化b區(qū)域也顯示出親和性的蛋白質(zhì)，已知有G蛋白（SpG)，但與Fc區(qū)域相比，對(duì)于化b 區(qū)域的親和性低。因此，如專利文獻(xiàn)2中記載的發(fā)明所述，也研究了在SpG中導(dǎo)入突變來(lái)提高 對(duì)于化b區(qū)域的親和性。然而，關(guān)于專利文獻(xiàn)2中記載的突變型SpG，沒(méi)能得到對(duì)于化b區(qū)域的 親和性為5倍W上高的突變型SpG，而野生型SpG對(duì)化b區(qū)域的親和性絕對(duì)不高，所W例如作 為用于純化不含F(xiàn)c區(qū)域的抗體片段的配體還不能說(shuō)是充分的。
[0019]因此，本發(fā)明的目的在于提供對(duì)IgG的Fab區(qū)域的結(jié)合能力極其優(yōu)異的Fab區(qū)域結(jié) 合性膚、具有該膚作為配體的親和分離基質(zhì)、W及使用了該親和分離基質(zhì)的含化b區(qū)域蛋白 質(zhì)的制造方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供編碼該膚的DNA、包含該DNA的載體、W及利 用該載體而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。 巧020] 用于解決問(wèn)題的方案
[0021] 本發(fā)明人等為解決上述問(wèn)題而進(jìn)行了深入研究。其結(jié)果，通過(guò)使用基因工程技術(shù) 得到許多G蛋白突變體，并對(duì)化b型片段抗體的結(jié)合力進(jìn)行了比較研究，成功地確定能夠提 高該結(jié)合力的突變位點(diǎn)，至此完成了本發(fā)明。
[0022] W下示出本發(fā)明。
[0023] [1] 一種化b區(qū)域結(jié)合性膚，其為下述(1)~(3)的任一者：
[0024] (1)具有來(lái)自G蛋白的m結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列即序列號(hào)1中選自第13位、第19位、第 30位和第33位的1個(gè)W上位點(diǎn)的氨基酸殘基被置換的氨基酸序列、并且與免疫球蛋白的化b 區(qū)域的結(jié)合力高于導(dǎo)入置換前的Fab區(qū)域結(jié)合性膚；
[002引（2)具有所述（1)規(guī)定的氨基酸序列中除了所述第13位、第19位、第30位和第33位 W外的區(qū)域中缺失、置換和/或添加了 1個(gè)W上、20個(gè)W下的氨基酸殘基的氨基酸序列、并且 與免疫球蛋白的化b區(qū)域的結(jié)合力高于具有序列號(hào)1的氨基酸序列的膚的化b區(qū)域結(jié)合性 膚;或者
[0026] (3)具有相對(duì)于所述（1)中規(guī)定的氨基酸序列具有80% W上的序列一致性的氨基 酸序列、并且與免疫球蛋白的化b區(qū)域的結(jié)合力高于具有序列號(hào)1的氨基酸序列的膚的化b 區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述(1)規(guī)定的氨基酸序列中的選自第13位、第19位、第30位和第33位 的1個(gè)W上位點(diǎn)的氨基酸殘基的置換在(3)中不進(jìn)一步突變。
[0027] [2]根據(jù)上述[1]所述的Fab區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述(1)規(guī)定的氨基酸序列中，第 13位的位點(diǎn)的氨基酸殘基被置換。
[0028] [3]根據(jù)上述[2]所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚，其中，第13位的氨基酸殘基被置換成 Thr或Ser。
[0029] [4]根據(jù)上述[1]~[3]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述（1)規(guī)定的氨 基酸序列中，第30位的氨基酸殘基被置換成化1、Leu或11 e。
[0030] [5]根據(jù)上述[1]~[4]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述（1)規(guī)定的氨 基酸序列中，第19位的氨基酸殘基被置換成化l、Leu或lie。
[0031] [6]根據(jù)上述[1]~[5]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述（1)規(guī)定的氨 基酸序列中，第33位的氨基酸殘基被置換成化e。
[0032] [7]根據(jù)上述[1]~[6]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述(2)規(guī)定的氨 基酸序列中，進(jìn)行了所述缺失、置換和/或添加的氨基酸殘基的位點(diǎn)為選自第2位、第10位、 第15位、第18位、第21位、第22位、第23位、第24位、第25位、第27位、第28位、第31位、第32位、 第35位、第36位、第39位、第40位、第42位、第45位、第47位和第48位的1個(gè)W上。
[0033] [引根據(jù)上述[1]~[6]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述(2)規(guī)定的氨 基酸序列中，進(jìn)行了所述缺失、置換和/或添加的氨基酸殘基的位點(diǎn)為N末端和/或C末端。
[0034] [9]根據(jù)上述[1]~[引的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚，其中，所述(3)規(guī)定的氨 基酸序列中，所述序列一致性為95% W上。
[0035] [10]-種化b區(qū)域結(jié)合性膚多聚體，其特征在于，具有連接了2個(gè)W上上述[1]~ [9]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚的多個(gè)結(jié)構(gòu)域。
[0036] [11]-種親和分離基質(zhì)，其特征在于，上述[1]~[9]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合 性膚或者上述[10]所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚多聚體作為配體被固定化于水不溶性載體。
[0037] [12] -種制造包含化b區(qū)域的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括：
[0038] 使上述[11]所述的親和分離基質(zhì)與含有包含F(xiàn)ab區(qū)域的蛋白質(zhì)的液體試樣接觸的 工序;和
[0039] 從親和分離基質(zhì)中分離與親和分離基質(zhì)結(jié)合的包含化b區(qū)域的蛋白質(zhì)的工序。
[0040] [13]-種DNA，其特征在于，編碼上述[1]~[9]的任一項(xiàng)所述的化b區(qū)域結(jié)合性膚。
[0041] [14] -種載體，其特征在于，包含上述[13]所述的DNA。
[0042] [1引一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其是由上述[14]所述的載體轉(zhuǎn)化而成的。
[004引發(fā)明的效果
[0044]由于本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚對(duì)于IgG的化b區(qū)域顯示出足夠高的親和性，所W 不僅對(duì)于通常的抗體，對(duì)于具有化b區(qū)域而不具有Fc區(qū)域的抗體片段也顯示出親和性。因 此，利用將本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚固定化在不溶性載體后的親和分離基質(zhì)也可對(duì)抗體 片段藥物進(jìn)行有效地純化。由此可見，近年來(lái)出于可W低成本制造等原因，對(duì)抗體片段藥物 的開發(fā)也日益盛行，本發(fā)明能夠有助于抗體片段藥物的實(shí)用化，所W在產(chǎn)業(yè)是非常有用的。 [00 4引更具體而言，本發(fā)明中令人驚奇地獲得了多個(gè)對(duì)化b區(qū)域的親和性提高了 10倍左 右的突變型SpG，進(jìn)而令人驚奇的是還獲得了提高50倍W上的突變型SpG。由此可見，作為用 于純化不含化區(qū)域的抗體片段的配體，本發(fā)明不僅成功地獲得了可實(shí)用的親和性，而且顯 示出可實(shí)現(xiàn)各種各樣的水平的親和性的多樣的突變方法。另外，本發(fā)明中所得到的突變型 SpG的解離速率常數(shù)與野生型相比顯著地變小，可獲得多個(gè)變?yōu)?/2W下的突變型SpG，令人 驚奇的是還獲得了變?yōu)?/10的突變體。若提高配體的解離速率常數(shù)，則可期待提高固定化 了該配體的親和分離基質(zhì)對(duì)含有化b區(qū)域的蛋白質(zhì)的保持性能。在運(yùn)些方面，可W說(shuō)本發(fā)明 表現(xiàn)出比專利文獻(xiàn)2中記載的發(fā)明更優(yōu)異的效果。
【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖1是表示野生型SpG-化的表達(dá)質(zhì)粒的制作方法的圖。
[0047] 圖2是W:野生型SpG-m、V:本發(fā)明中所得到的突變型SpG-m對(duì)于抗TN化單克隆抗 體