一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高食用菌液體發(fā)酵中三萜含量的方法，具體涉及一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法。
技術(shù)背景
[0002]靈芝[Ganodermalucidum(Curtis:Fr.)P.Karst]古稱為瑞草，又名為赤芝、萬(wàn)年蕈、紅芝、靈芝草等，在真菌的分類地位上屬于真菌界(Mycota)，擔(dān)子菌亞門(Basid1mycotina),層菌亞綱(取!1161101115^6丨68)，非裙菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyproraceae)，靈芝屬(Ganoderma)。靈芝三蔽具有良好的藥理作用，主要表現(xiàn)在抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、保肝護(hù)肝、降血壓、抗HIV等。
[0003]靈芝品質(zhì)的好壞與靈芝三萜的含量著密切相關(guān)。目前生產(chǎn)上獲得靈芝三萜類化合物的來源主要是成熟子實(shí)體和液體發(fā)酵的菌絲。通過液體發(fā)酵技術(shù)來提取靈芝的三萜的周期較短，且操作簡(jiǎn)單。隨著市場(chǎng)上靈芝產(chǎn)品的不斷推出，就要求更加高效地生產(chǎn)靈芝三萜。因此，探索如何有效提高靈芝液體發(fā)酵中三萜的含量，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法，適應(yīng)市場(chǎng)需求，也為靈芝有效成分分析提供依據(jù)。
[0005]本發(fā)明的一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法，操作步驟如下:
(1)配制CaCl2水溶液和水楊酸乙醇溶液:用CaCl2和無(wú)菌水配制1OmMl?離子水溶液；用水楊酸和乙醇，配制150μΜ水楊酸乙醇溶液；
(2)菌絲液體培養(yǎng):用9mm打孔器從長(zhǎng)滿靈芝菌絲的平板上打出8塊菌絲接入100mL液體TOA中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)6-7天，然后再靜置培養(yǎng)5_6天;所述液體PDA配方為:200 g馬鈴薯煮沸浸出液，20 g葡萄糖，加水定容到1000mL，121°C滅菌30min;
(3)鈣離子和水楊酸誘導(dǎo):取步驟(1)的鈣離子水溶液l_5mL和水楊酸乙醇溶液0.5-
1.5mL，混勾，采用濾膜除菌法加入到步驟(2)已接種培養(yǎng)的PDA培養(yǎng)液中，28°C生化培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)處理1-2天；
(4)菌絲收集:收集步驟(3)誘導(dǎo)處理后的菌絲，并除去接種塊，用蒸餾水洗滌3-5次，置于60°C烘箱中烘干至恒重；
(5)菌絲三萜提取與檢測(cè):取步驟(4)烘干的菌絲用乙醇常溫浸提2h后，150W超聲0.5h，60°C旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇溶解定容，并采用香草醛-冰醋酸法檢測(cè)三萜含量。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益之處:在靈芝液體發(fā)酵過程中加入鈣離子和水楊酸進(jìn)行誘導(dǎo)，能夠顯著提高靈芝菌絲中三萜的含量，提高靈芝的質(zhì)量，而且操作簡(jiǎn)單成本低。靈芝三萜是靈芝中主要的藥理活性成分，通過添加鈣離子和水楊酸的誘導(dǎo)，能夠有效的提高靈芝液體發(fā)酵中三萜的含量，菌絲的三萜含量達(dá)48.97 mg/g，比對(duì)照組高48.26%。
【附圖說明】
[0007 ]圖1為不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲的三蔽含量不意圖。圖中，橫坐標(biāo)表不培養(yǎng)的天數(shù)，縱坐標(biāo)表不三蔽含量mg/g。
[0008]圖2為添加鈣離子和水楊酸對(duì)靈芝三萜含量的影響示意圖。圖中，CK為對(duì)照，Ca+SA表示用本發(fā)明的方法添加鈣離子和水楊酸進(jìn)行誘導(dǎo)處理；*表示與對(duì)照有顯著差異，P<
0.05；縱坐標(biāo)表不三蔽含量mg/g。未添加?jì)岆x子和水楊酸的菌絲，三蔽含量為33.03 mg/g；添加鈣離子和水楊酸的菌絲三萜含量為48.97 mg/g，比對(duì)照組高48.26%。
【具體實(shí)施方式】
[0009]為了充分公開本發(fā)明的提高靈芝液體發(fā)酵中三萜的含量的方法，以下結(jié)合實(shí)例加以說明。
[0010]實(shí)施例1:一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法。包括以下步驟:
(1)配制CaCl2水溶液和水楊酸乙醇溶液:用CaCl2和無(wú)菌水配制10mMl?離子水溶液；用水楊酸和乙醇，配制150μΜ水楊酸乙醇溶液；
(2)菌絲液體培養(yǎng):采用市場(chǎng)購(gòu)買的靈芝菌株，在PDA斜面進(jìn)行活化后接入90mm的平板，待平板上長(zhǎng)滿菌絲后，用9mm打孔器打出8塊菌絲接入100 mL液體PDA中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)7天，然后再靜置培養(yǎng)5天;所述液體PDA配方為:200 g馬鈴薯煮沸浸出液，20 g葡萄糖，加水定容到1000mL，121°C滅菌30min;不同培養(yǎng)時(shí)間菌絲的三萜含量如圖1所示；當(dāng)培養(yǎng)到第13天，菌絲中三萜含量達(dá)到最大值33.03mg/go
[0011 ] (3)鈣離子和水楊酸誘導(dǎo):取步驟(1)的鈣離子水溶液lmL和水楊酸乙醇溶液lmL，混勻，采用濾膜除菌法，即采用lmL無(wú)菌注射器經(jīng)孔徑為0.22μπι已滅菌的有機(jī)濾頭，加入到步驟(2)已接種培養(yǎng)的TOA培養(yǎng)液中，28°C生化培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)處理1天。添加鈣離子和水楊酸對(duì)靈芝三萜含量的影響如圖2所示，添加鈣離子和水楊酸的菌絲三萜含量為48.97 mg/g，比對(duì)照組高48.26%。
[0012](4)菌絲收集:收集步驟(3)誘導(dǎo)處理后的菌絲，并除去接種塊，用蒸餾水洗滌5次，置于60°C烘箱中烘干至恒重；
(5)菌絲三萜提取與檢測(cè):稱取烘干的菌絲0.2g，用30mL85%(v/v)乙醇常溫浸提2h后，150W超聲0.5h，60°C旋轉(zhuǎn)蒸干，最后用甲醇溶解定容至25 mL。采用香草醛-冰醋酸法檢測(cè)三蔽含量。
[0013]所述香草醛-冰醋酸法檢測(cè)三萜含量:取0.2mL的樣品溶液于具塞試管中，在60°C水浴鍋中蒸干，加入0.4mL的5%香草醛-冰醋酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)和lmL的高氯酸，搖勻后60°C水浴15min.冷卻至室溫后再加入5mL的冰醋酸，搖勻后室溫靜置0.5h，546nm進(jìn)行0D值檢測(cè)。
[0014]實(shí)施例2:—種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法。包括以下步驟:
(1)配制CaCl2水溶液和水楊酸乙醇溶液:用CaCl2和無(wú)菌水配制10mMl?離子水溶液；用水楊酸和乙醇，配制150μΜ水楊酸乙醇溶液；
(2)菌絲液體培養(yǎng):采用市場(chǎng)購(gòu)買的靈芝菌株，在PDA斜面進(jìn)行活化后接入90mm的平板，待平板上長(zhǎng)滿菌絲后，用9mm打孔器打出8塊菌絲接入100 mL液體PDA中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)6天，然后再靜置培養(yǎng)6天； (3)鈣離子和水楊酸誘導(dǎo):取步驟(1)的鈣離子水溶液5mL和水楊酸乙醇溶液1.5mL，混勻，采用濾膜除菌法加入到步驟(2)已接種培養(yǎng)的的PDA培養(yǎng)液中，28°C生化培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)處理2天。
[0015](4)菌絲收集:用紗布收集步驟(3)誘導(dǎo)處理后的菌絲，并除去接種塊，用蒸餾水洗滌3次，置于60°C烘箱中烘干至恒重。
[0016](5)菌絲三萜提取與檢測(cè):稱取烘干的菌絲0.2g，用30mL85%(v/v)乙醇常溫浸提2h后，150W超聲0.5h，60°C旋轉(zhuǎn)蒸干，最后用甲醇溶解定容25 mL，并采用香草醛-冰醋酸法檢測(cè)三萜含量。
[0017]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法，其特征在于操作步驟如下: (1)配制CaCl2水溶液和水楊酸乙醇溶液:用CaCl2和無(wú)菌水配制lOmMli離子水溶液；用水楊酸和乙醇，配制150μΜ水楊酸乙醇溶液； (2)菌絲液體培養(yǎng):用9mm打孔器從長(zhǎng)滿靈芝菌絲的平板上打出8塊菌絲接入100mL液體TOA中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)6-7天，然后再靜置培養(yǎng)5_6天;所述液體PDA配方為:200 g馬鈴薯煮沸浸出液、20 g葡萄糖、加水定容到1000mL，121°C滅菌30min; (3)鈣離子和水楊酸誘導(dǎo):取步驟(1)的鈣離子水溶液1_5mL和水楊酸乙醇溶液0.5-1.5mL，混勾，采用濾膜除菌法加入到步驟(2)已接種培養(yǎng)的PDA培養(yǎng)液中，28°C生化培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)處理1-2天； (4)菌絲收集:收集步驟(3)誘導(dǎo)處理后的菌絲，并除去接種塊，用蒸餾水洗滌3-5次，置于60°C烘箱中烘干至恒重； (5)菌絲三萜提取與檢測(cè):取步驟(4)烘干的菌絲用乙醇常溫浸提2h后，150W超聲0.5h，60°C旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇溶解定容，并采用香草醛-冰醋酸法檢測(cè)三萜含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法，其特征在于所述菌絲液體培養(yǎng):用9mm打孔器從長(zhǎng)滿靈芝菌絲的平板上打出8塊菌絲接入100 mL液體PDA中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)7天，然后再靜置培養(yǎng)5天。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法，其特征在于所述鈣離子和水楊酸誘導(dǎo):取鈣離子水溶液lmL和水楊酸乙醇溶液lmL，混勻，采用濾膜除菌法加入到已接種培養(yǎng)的PDA培養(yǎng)液中，28°C生化培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)處理1天。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高靈芝液體發(fā)酵中三萜含量的方法，包括配制CaCl2水溶液和水楊酸乙醇溶液、菌絲液體培養(yǎng)、鈣離子和水楊酸誘導(dǎo)、菌絲收集、菌絲三萜提取與檢測(cè)。在靈芝液體發(fā)酵過程中加入鈣離子和水楊酸進(jìn)行誘導(dǎo)，能夠顯著提高靈芝菌絲中三萜的含量，菌絲的三萜含量達(dá)48.97？mg/g，比對(duì)照組高48.26%，有效提高靈芝的質(zhì)量，而且操作方法簡(jiǎn)單、成本低。
【IPC分類】C12R1/645, C12P33/00
【公開號(hào)】CN105483197
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510983745
【發(fā)明人】吳小平, 葉麗云, 林強(qiáng)
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年12月24日