0yLFA-UFA-2和大豆葉酸待測液分別加入 96孔板的第1列，從第1列吸取混合液150μ1至第2列，在從第2列吸取混合液150μ1至第3列， 再從第3列吸取混合液150μ1至第4列，在從第4列吸取混合液150μ1至第5列，再從第5列吸取 混合液150μ1至第6列，最后將第6列的樣品混合液棄去其中150μ1;將加入指示菌的FACM培 養(yǎng)基150yL加入96孔板中；將培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)18-20h;在波長為580nm條件下，測定樣品 的0D值;根據(jù)測定數(shù)值建立標準曲線并計算出樣品中包含的葉酸濃度。
【具體實施方式】
[0030]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所用僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明 的限制。
[0031 ]實施例1大豆樣品制備
[0032]大豆種子粉碎獲取豆粉，稱取豆粉0.2g，置于2mLAXYGENEP管中，三次重復(fù)。在每 份樣品中加入750yL葉酸提取緩沖液(50mM磷酸緩沖液，PH= 6.5，1 %抗壞血酸鈉鹽，Ο. 1 % 2-巰基乙醇），在95°C孵育15min置于冰上冷卻，之后加入5mm鋼珠，在組織研磨機中研磨樣 品(轉(zhuǎn)速為1400rpm，時間為5min)。樣品研磨過程均需避光操作。
[0033]實施例2大豆葉酸提取
[0034]在樣品勻漿液中加入8yLa-淀粉酶和750yL葉酸提取緩沖液以避免粘稠，室溫放置lOmin，加入lOOyL蛋白酶，37°C孵育lhr; 100°C煮沸上述混合物lOmin以終止酶作用，冰上迅 速冷卻lOmin;在4°C，14000rpm條件下，離心lOmin;吸取上清，按照2 %的體積在上清中加 入大鼠血清10yL，混勻后，于37°C培養(yǎng)2h;100°C煮沸滅活lOmin，冰上迅速冷卻lOmin;在4 °C，14000rpm條件下，離心15min;吸取上清分裝于滅菌管中直接測定或凍存于-80°C。樣品 提取過程均需避光操作。
[0035]實施例3大豆葉酸的微生物檢測方法 [0036] (1)試劑配制
[0037] 乳酸菌液體培養(yǎng)基:4.85g乳酸菌培養(yǎng)基質(zhì)加入lOOmL水中，121°C滅菌15min。
[0038]低葉酸培養(yǎng)基：稱取4.7g葉酸培養(yǎng)基粉末、0.03g抗環(huán)血酸、0.3mL葉酸標準儲配 液，加水溶解定容至lOOmL，過0.22μπι濾膜滅菌備用。
[0039] 分析緩沖液:稱取Na2HP〇4.2Η20 0.38g、NaH2P〇4〇.93g、抗環(huán)血酸lg加水溶解定容至 1OOmL，過0.22μηι濾膜滅菌備用。
[0040]葉酸培養(yǎng)基:稱取葉酸培養(yǎng)基粉末9.4g，加水溶解定容至lOOmL，煮沸5min，過0.22μπι濾膜滅菌備用。
[0041] (2)葉酸標準樣品制備
[0042] 稱取28mg葉酸溶于4mL5^^K2HP〇4溶液中，然后用分析緩沖液定容至250mL，在吸 取0.5mL此溶液用分析緩沖液定容至lOOmL，得濃度為0.5yg/mL的標準儲備液FA，分裝到 1.5mLEP管中并保存于-20°C。
[0043] (3)指示菌的制備
[0044] 吸取乳酸菌保存菌液500yL加入到10mL乳酸菌液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)24h， 再次吸取培養(yǎng)好的菌液0.5mL加入到lOOmL低葉酸培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)18h;三角瓶置于 冰上冷卻20min。將預(yù)冷的甘油與培養(yǎng)物混合(體積比為40:60)，充分攪拌均勻;分裝菌液于 1.5mLEP管中，液氮速凍后于-80°C保存。
[0045] (4)葉酸含量測定
[0046]利用分析緩沖液FA溶液稀釋250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析緩沖液 稀釋，得到FA-2溶液;FA-1和FA-2溶液均用于制作標準曲線;將葉酸樣品短暫離心，用分析 緩沖液稀釋樣品30倍;在96孔板中，將150yL分析緩沖液加入每個樣品孔后，再將150yLFA- 1、FA-2和大豆葉酸待測液分別加入96孔板的第1列，從第1列吸取混合液150μ1至第2列，在 從第2列吸取混合液150μ1至第3列，再從第3列吸取混合液150μ1至第4列，在從第4列吸取混 合液150μ1至第5列，再從第5列吸取混合液150μ1至第6列，最后將第6列的樣品混合液棄去 其中150μ1;將加入指示菌的FACM培養(yǎng)基150yL加入96孔板中；將培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)18-20h;在波長為580nm條件下，測定樣品的0D值;根據(jù)測定數(shù)值建立標準曲線并計算出樣品中 包含的葉酸濃度。
[0047]實施例4:發(fā)明效果的檢測
[0048]對本發(fā)明中α_淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清三種酶的使用量進行摸索及優(yōu)化，α_淀 粉酶的使用量分別為2、4、8、10和20yL，蛋白酶(使用濃度為1Omg/mL)的使用量分別為40、 80、100、150和200yL，大鼠血清的使用量分別為0、10、20、30、40yL。將不同的酶使用量按照 三因素五水平進行組合，共125組。對125個組合的大豆品種Williams82進行葉酸含量測 定，3次重復(fù)，結(jié)果見表1。經(jīng)計算不同濃度條件下的葉酸含量均值發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶、蛋白酶和 大鼠血清的組合在8yL，100yL及10yL的條件下能夠最大程度地提取大豆種子中的葉酸。 [0049] 表1大豆品種Williams82在不同酶組合中的葉酸含量(單位:yg/100g)
[0050]

[0052]
[0053]分別稱取不同大豆品種0.2g，置于2mLEP管中，三次重復(fù)。在每份樣品中加入750yL 葉酸提取緩沖液，在95°C孵育15min置于冰上冷卻，之后加入5mm鋼珠，在組織研磨機中研磨 樣品（轉(zhuǎn)速為1400rpm，時間為5min)。
[0054]在樣品勻漿液中加入8yLa-淀粉酶和750yL葉酸提取緩沖液以避免粘稠，室溫放置lOmin，加入lOOyLa-蛋白酶，37°C孵育lhr; 100°C煮沸上述混合物lOmin以終止酶作用，冰上 迅速冷卻lOmin;在4°C，14000rpm條件下，離心lOmin;在上清中加入大鼠血清10yL，混勾后， 于37°C培養(yǎng)2hr; 100°C煮沸滅活lOmin，冰上迅速冷卻lOmin;在4°C，14000rpm條件下，離心 15min;吸取上清分裝于滅菌管中直接測定。
[0055]用分析緩沖液將標準儲備液FA溶液稀釋250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用 分析緩沖液稀釋，得到FA-2溶液。FA-1和FA-2溶液均用于制作標準曲線;將葉酸樣品短暫離 心，用分析緩沖液稀釋樣品30倍。在96孔板中，將150yL分析緩沖液加入每個樣品孔后，再將 150yLFA-l、FA-2和提取水稻葉酸樣品分別加入96孔板的第1列或第7列，從第1列或第7列 吸取混合液150μ1至第2孔或第8孔，依次類推，待第6列或第12列的樣品混合液體積為300yL 后，棄去其中150μ1;將加入指示菌的FACM培養(yǎng)基150yL加入96孔板中（指示菌/FACM培養(yǎng)基 的比例為1:100);將培養(yǎng)板置于37°(3培養(yǎng)18-201^;在波長為58011111條件下，測定樣品的00 值;根據(jù)測定數(shù)值建立標準曲線并計算出樣品中包含的葉酸濃度。結(jié)果見表2.
[0056] 表2121份北方地區(qū)大豆種子的葉酸含量(單位:yg/100g)
[0057]
[0058]
【主權(quán)項】
1. 從大豆中提取葉酸的方法，包括以下步驟： (1) 大豆樣品制備：大豆種子粉碎獲取豆粉，稱取0.2g豆粉，置于AXYGENEP管中，在樣 品中加入750yL葉酸提取緩沖液，95°C孵育15min置于冰上冷卻，加入5mm鋼珠(2粒），在組織 研磨機中研磨樣品，獲得樣品勻漿液； (2) 大豆葉酸提取:在步驟（1)樣品勻漿液中加入8yLa-淀粉酶和750yL葉酸提取緩沖液 以避免粘稠，室溫放置lOmin，加入lOOyL蛋白酶，37°C孵育lh; 100°C煮沸l(wèi)Omin，冰上迅速冷 卻lOmin;在4°C，14000rpm條件下，離心lOmin;吸取上清，按照2 %的體積比在上清中加入大 鼠血清10yL，混勻后，于37°C培養(yǎng)2h; 100°C煮沸滅活lOmin，冰上迅速冷卻lOmin;在4°C， 14000rpm條件下，離心15min;吸取上清分裝于滅菌管中直接測定或凍存于-80°C，得大豆葉 酸提取液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從大豆中提取葉酸的方法，其特征在于，所述步驟（1)大豆樣 品制備和步驟(2)大豆葉酸提取，均在避光條件下進行。3. 根據(jù)權(quán)利要求從1所述的從大豆中提取葉酸的方法，其特征在于，步驟(2)中所述緩 沖液的組分為pH值6.5的50mM磷酸緩沖液中，加入1 %的抗壞血酸鈉鹽，以及0.1 %的2-巰基 乙醇。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物提取物的制備領(lǐng)域，具體地涉及一種大豆種子中葉酸的提取方法。人類和動物不能自身合成葉酸，各種作物是人類和動物獲取這一維生素的主要來源。作物中葉酸的提取，常用的有單酶法和三酶法。不同食物中使用的三酶法提取條件是不同的，有必要對每種類型食物分別進行葉酸提取的優(yōu)化。本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的從大豆種子中提取葉酸的方法，利用本方法，可以同時對上百個樣品同時進行提取，使提取過程快捷高效。
【IPC分類】C07D475/04, G01N21/31
【公開號】CN105440036
【申請?zhí)枴緾N201610004854
【發(fā)明人】張玲, 孟繁磊, 張原宇, 王玉民, 李海云, 邢國杰, 董英山
【申請人】吉林省農(nóng)業(yè)科學院
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2016年1月5日