引物設(shè)計(jì)（NM_021245. 3)。
[0070]MY0Z1的上、下游引物序列分別為：
[0071]上游引物：5'-ATCCTTCCTCACCAACTC-3'；SEQIDNO. 1
[0072]下游引物：5'-GCAGAGCAAATTCCATAAAC-3'；SEQIDNO. 2
[0073] 產(chǎn)物長(zhǎng)度為76bp。
[0074] 內(nèi)參β-actin上、下游引物序列分別為：
[0075]上游引物：5'-TAATCTTCGCCTTAATACT-3'；SEQIDN0. 3
[0076]下游引物：5'-CCTTCATACATCTCAAGT-3'；SEQIDΝ0· 4
[0077] 產(chǎn)物長(zhǎng)度為103bp。
[0078] 2.3定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0079] 標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的制備
[0080] 按照說明書，從口腔癌組織中，利用超純RNA提取試劑盒（貨號(hào)CW0597)提取總 RNA，接著用康為世紀(jì)SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒（貨號(hào)CW0741)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 具體步驟如下：1·將RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、RTBuffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。
[0081] 2.配置反應(yīng)體系，總體積為20μ1 :終濃度為50pg_5μg的RNA模板、2μ1Primer Mix、4μ1dNTPMix、4μ1RTBuffer、1μlSuperRT，加RNase-FreeWater補(bǔ)平到 20μl〇
[0082] 3.渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
[0083] 4. 42°C孵育30-50分鐘，85°C孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
[0084] 將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA用康為世紀(jì)2XTaqMasterMix(貨號(hào)CW0682)進(jìn)行常 規(guī)PCR，反應(yīng)體系和條件如下：2XTaqMasterMix25μ1、上下游引物各2yl、cDNA0.5yg、 補(bǔ)平至50μ1。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2min;94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸30s， 30cycles;最后 72°C延伸 2min。
[0085] 取樣5μL，對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)行切膠回收并純化， 將純化產(chǎn)物連接到pGM-T克隆載體，隨后轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。通過序列為SEQ IDNO. 1和SEQIDΝ0. 2的特異性引物篩選陽性克隆。陽性克隆擴(kuò)增后提取質(zhì)粒DNA，質(zhì) 粒DNA米用NanoDropND-1000 核酸定量?jī)x定量（NanoDropTechnologies，Wilmington， Delaware)并做10倍系列稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（標(biāo)準(zhǔn)DNA模板濃度范圍在 108_102copies/μ1) 〇
[0086] 2. 3敏感性實(shí)驗(yàn)
[0087] 取重組質(zhì)粒按比例稀釋為108、107、10 6、105、104、103、102個(gè)拷貝/^1^，進(jìn)行熒光定 量PCR，以檢測(cè)為陽性的最低濃度為該方法的檢測(cè)靈敏度。本研究所建立的方法檢測(cè)范圍為 108_10 2copies/yL，最小檢出濃度為 100copies/yL。
[0088] 2. 4qRT-PCR檢測(cè)MY0Z1基因表達(dá)量
[0089] 取上述49例口腔癌癌變組、癌旁組和23例正常組超純RNA提取試劑盒（貨號(hào) CW0597)提取總RNA，進(jìn)而用UltraSYBR-步法熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)CW0660)進(jìn)行RT-PCR。具體步驟：
[0090] 1.將RNA模板、引物、2XUltraSYBROneSt印RT-qPCRBuffer(WithR0X)、 SuperEnzymeMix和RNase-FreeWater溶解并置于冰上備用。
[0091] 2.RT-PCR反應(yīng)體系（25μ1) :2XUltraSYBROneSt印RT-qPCRBuffer(With ROX) 12. 5μ1、上游引物（10μM)0. 5μ1、下游引物（10μM)0. 5μ1、SuperEnzymeMix 0· 5μ1、加RNA模板（終濃度為lOpg-lOOng)、RNase-FreeWater補(bǔ)平至 25μl〇
[0092] 3.渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。
[0093] 4.將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45°C，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，按以下反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)： 反轉(zhuǎn)錄：45°C10min;95°C5min預(yù)變性，接 35 個(gè)循環(huán)：95°C10s，60°C30s。
[0094] 對(duì)qRT-PCR反應(yīng)結(jié)果使用SPSSForWindows11. 5軟件，相關(guān)數(shù)據(jù)采用x2檢驗(yàn) 和Fisher確切概率法進(jìn)行處理，P< 0. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；qRT-PCR反應(yīng)利用MedCalc統(tǒng)計(jì) 分析軟件來計(jì)算。
[0095] 根據(jù)qRT-PCR的相對(duì)定量公式：2_ACtX100%，比較MY0Z1基因在口腔癌組、癌旁 組和正常組中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中MY0Z1在正常組織、癌 旁組織中的表達(dá)水平在明顯高于癌組織，其中正常組織約為癌組織的6倍、癌旁組織約為 癌組織的6.5倍（具體見圖1)，以上結(jié)果驗(yàn)證高通量分析結(jié)果中MY0Z1在口腔癌組織中低 表達(dá)。
[0096] 實(shí)施例4細(xì)胞的培養(yǎng)
[0097] 口腔鱗狀癌細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所， 采用含1〇%胎牛血清、1〇〇1]/1111青霉素和100以8/1111鏈霉素的01^1培養(yǎng)液，于含5%0) 2的 37 °C飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0098] 細(xì)胞復(fù)蘇：
[0099] 首先將恒溫水浴箱預(yù)熱至37°C，細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)臺(tái)面用75%乙醇擦洗，然后 紫外燈消毒30min。細(xì)胞復(fù)蘇的原則是快速融化，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短時(shí)間內(nèi)即 融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。從液氮罐中 取出凍存管，插入浮板并迅速置入37°C水浴箱中，不停搖動(dòng)盡快使管中液體融化。一般約 lmin內(nèi)融化，用乙醇消毒凍存管外壁及雙手，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入 15ml離心管內(nèi)并滴加10倍體積的新鮮培養(yǎng)液，吹打均勻后，800rpm離心5min，除去上清，再 重復(fù)用新鮮培養(yǎng)液洗一次。用新鮮培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入5% 0)2的37°C飽 和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài)，更換培養(yǎng)液或傳代。
[0100] 細(xì)胞傳代：
[0101] 細(xì)胞傳代待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底部80% -90 %密度時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將原來的 培養(yǎng)液吸除，用PBS緩沖液輕緩漂洗細(xì)胞1-2次，盡量洗去殘余血清，棄PBS平衡鹽溶液。加 入0. 5-lml0. 02%EDTA+0. 25%胰蛋白酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中，瓶口蓋好，于室 溫或37°C條件下消化0. 5-3min。倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，隨著時(shí)間的推移，原貼壁的 細(xì)胞邊黑，逐漸趨于圓形，細(xì)胞之間間隙增大不再連接成片，表示此時(shí)消化適度。在細(xì)胞還 未飄起時(shí)立即加入適量含血清的新鮮培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，并用吸管吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液 反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底壁，使已消化的細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底壁。吹打過程須按一定順序操作，即要 從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是培養(yǎng)瓶底壁四周的邊緣地帶，確保培養(yǎng)瓶底壁各處的細(xì) 胞均被吹打脫落。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過猛，同時(shí)盡可能不要出現(xiàn)氣泡，這些都對(duì)細(xì) 胞有損傷。收集經(jīng)吹打后得到的細(xì)胞懸液至15ml離心管內(nèi)，800rpm離心5min，除去上清， 立即加入含血清的新鮮培養(yǎng)液，輕緩吹打形成細(xì)胞懸液。按1:2或1:3分配傳代培養(yǎng)，加入 適量培養(yǎng)液后旋緊培養(yǎng)瓶蓋，并在培養(yǎng)瓶側(cè)面做好標(biāo)記，置5% 032的37°C飽和濕度培養(yǎng)箱 中繼續(xù)培養(yǎng)。24-48h更換培養(yǎng)液，一般3-4天形成細(xì)胞單層即可傳代，若不馬上傳代可更換 培養(yǎng)液以供實(shí)驗(yàn)用。
[0102] 細(xì)胞計(jì)數(shù)：
[0103] 培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì) 數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示，其原理和方法與血細(xì)胞技術(shù)相同。首先將待測(cè)細(xì)胞制 成均勻的細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板及