6]9)重復(fù)步驟8)；
[0087]10)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 700 μ 1 RWT buffer, lOOOOrpm離心15s，棄下層液體；
[0088]11)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 RPE buffer, lOOOOrpm離心15s，棄下層液體；
[0089]12)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 80% 無水乙醇，lOOOOrpm離心2min，棄下層液體；
[0090]13)將洗脫膜植入新2ml收集管，打開蓋子，最高速度離心5min ；
[0091]14)將洗脫膜植入新1.5ml收集管中，加入20 μ 1無酶水，最高速度離心lmin ；
[0092]15)離心后，收集管中即為總RNA ;
[0093]16)使用超微量分光光度計測量提取的總RNA濃度。
[0094]步驟(3)反轉(zhuǎn)錄的方法是:
[0095]1)配置反轉(zhuǎn)錄液(20 μ 1):
[0096]5XPrimeScriptBuffer,4 μ 1 ；
[0097]PrimeScriptRT Enzyme Mix，1 μ 1 ；
[0098]miR-18a-5p 反轉(zhuǎn)錄引物(2 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0099]cel-39 反轉(zhuǎn)錄引物(2 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0100]cel-39standard (0.1 μ Μ)，1 μ 1 ；
[0101]總RNA(lOOng)，1 μ 1
[0102]無酶水，補足20 μ 1。
[0103]2)反應(yīng)條件:
[0104]Stepl:42°C, 15min ；
[0105]Step2:85°C，5s。
[0106]步驟(4)預(yù)擴增的方法是:
[0107]1)配制預(yù)擴增液(12.5 μ 1)
[0108]cDNA, 1 μ 1 ；
[0109]miR-18a-5p 上游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0110]miR-18a-5p 下游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0111]2 X Taq PCR MasterMix,6.25 μ 1 ；
[0112]無酶水，4.25μ 1。
[0113]2)反應(yīng)條件(普通PCR儀)
[0114]Reps:94°C，3min ;
[0115]Reps:94°C，30s ;60°C，30s ;72°C，lmin ;lOcycles ；
[0116]Reps:72°C, 5min0
[0117]步驟(5) qPCR的方法是:
[0118]1)配制PCR反應(yīng)液(20 μ 1體系)
[0119]SYBRPremix Ex Taq II, 10 μ 1 ；
[0120]上游引物(10uM)，0.5μ1 ;
[0121]下游引物(10ιιΜ)，0.5μ1;
[0122]ROX II, 0.4 μ 1 ；
[0123]預(yù)擴增液，2μ1;
[0124]無酶水，6.6μ 1。
[0125]2)反應(yīng)條件
[0126]Reps:95°C, 30s ；
[0127]Reps:95°C，5s ;60°C，34s ;40cycles。
[0128]步驟(6)中miRNA判讀標準:
[0129]miR-18a-5p/cel_39>2.28。
[0130]本發(fā)明該檢測技術(shù)中miR-18a-5p的敏感性和特異性分別87 %和95 %。miR-18a-5p/cel-39>2.28 的患者，可給予較低放療劑量(56_60Gy)，miR-18a_5p/cel-39彡2.28的患者，需給予較高放療劑量(66_70Gy)。
[0131]本發(fā)明設(shè)計合理，血漿miR-18a_5p可反映腫瘤細胞的生物學特性，檢測血漿miR-18a水平，預(yù)測肺癌患者放療敏感性，具有快速、簡潔、準確的優(yōu)點。
[0132]本發(fā)明不局限于上述最佳實施方式，任何人應(yīng)該得知在本發(fā)明的啟示下做出的結(jié)構(gòu)變化，凡是與本發(fā)明具有相同或者相近似的技術(shù)方案，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.血楽miRNA水平指導非小細胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，特征在于:步驟如下: (1)、抽取肺癌患者放療前外周血，提取血漿； (2)、分離純化血漿總RNA;(3)、以cel-miR-39-3p(cel-39)作為外參照，與miR-18a_5p反轉(zhuǎn)錄引物一起進行反轉(zhuǎn)錄; (4)、加入miR-18a-5pPCR引物進行10個循環(huán)的預(yù)擴增； (5)、加入cel-39引物與miR-18a_5pPCR引物，qPCR法檢測肺癌患者血漿miR-18a_5p水平； (6)、miRNA判讀標準:miR-18a-5p/cel-39>2.28。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，血漿miRNA水平指導非小細胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，特征在于:步驟(2)分離純化血漿總RNA的方法如下: 1)取200μ 1血漿于1.5ml EP管中； 2)向EP管中加入1000μ 1 QIAzol Lysis Reagent裂解液，旋轉(zhuǎn)混勾； 3)室溫下放置5min； 4)加入200μ 1三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混勻15s ； 5)室溫下放置2-3min；6)4°C,12000g 離心 15min ； 7)將上清液(600μ 1)轉(zhuǎn)移到新1.5ml EP管中，加入900 μ 1無水乙醇； 8)將步驟8 的混合液體 750 μ 1 加入 2ml RNeasy MinElute Spin Columns，室溫lOOOOrpm離心15s，棄下層液體； 9)重復(fù)步驟8); 10)向2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 700 μ 1 RWT buffer，lOOOOrpm 離心15s，棄下層液體； 11)向2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 RPE buffer，lOOOOrpm 離心15s，棄下層液體； 12)向2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 80%無水乙醇，lOOOOrpm離心2min，棄下層液體； 13)將洗脫膜植入新2ml收集管，最高速度離心5min; 14)將洗脫膜植入新1.5ml收集管中，加入20 μ 1無酶水，最高速度離心lmin ； 15)離心后，收集管中即為總RNA； 16)使用超微量分光光度計測量提取的總RNA濃度。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，血漿miRNA水平指導非小細胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，特征在于:步驟(3)反轉(zhuǎn)錄的方法是: 1)配置反轉(zhuǎn)錄液(20 μ 1):5XPrimeScriptBuffer，4 μ 1 ；PrimeScript RT Enzyme Mix，1 μ 1 ；miR-18a-5p 反轉(zhuǎn)錄引物(2μΜ)，0.5μ1 ;cel-39 反轉(zhuǎn)錄引物(2μΜ)，0.5μ1 ；cel-39standard(0.1 μ Μ)，1 μ 1 ；總 RNA(lOOng)，1 μ 1無酶水，補足20 μ Ιο2)反應(yīng)條件:Stepl:42 °C，15min ；St印2:85°C，5s。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，血漿miRNA水平指導非小細胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，特征在于:步驟(4)預(yù)擴增方法是: 1)配制預(yù)擴增液(12.5 μ 1) cDNA，1 μ 1 ；miR-18a-5p 上游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;miR-18a-5p 下游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;2 X Taq PCR MasterMix,6.25 μ 1 ； 無酶水，4.25μ1 ； 2)反應(yīng)條件(普通PCR儀)Reps:94°C，3min ；Reps:94°C，30s ；60°C，30s ;72°C，lmin ； lOcycles ；Reps:72°C,5min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，血漿miRNA水平指導非小細胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，特征在于:步驟(5)qPCR方法是: 1)配制PCR反應(yīng)液(20μ 1體系)SYBR Premix Ex Taq II,10 μ 1 ； 上游引物(10uM)，0.5μ1 ； 下游引物(10uM)，0.5μ1 ；ROX II，0.4 μ 1 ; 預(yù)擴增液，2 μ 1 ;無酶水，6.6 μ 1 ； 2)反應(yīng)條件 Reps:95°C，30s ；Reps:95°C，5s ;60°C，34s ;40cycles。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，血漿miRNA水平指導非小細胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，特征在于:步驟￠)中判讀標準:miR-18a-5p/cel-39>2.28。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血漿miRNA水平指導非小細胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，步驟如下：(1)、抽取肺癌患者放療前外周血，提取血漿；(2)、分離純化血漿總RNA；(3)、以cel-miR-39-3p(cel-39)作為外參照，與miR-18a-5p反轉(zhuǎn)錄引物一起進行反轉(zhuǎn)錄；(4)、加入miR-18a-5pPCR引物進行10個循環(huán)的預(yù)擴增；(5)、加入cel-39引物與miR-18a-5pPCR引物，qPCR法檢測肺癌患者血漿miR-18a-5p水平；(6)、miRNA判讀標準：miR-18a-5p/cel-39>2.28。本發(fā)明設(shè)計合理，血漿中miRNAs可反映腫瘤細胞的生物學特性，檢測血漿中miRNA表達水平，從而預(yù)測肺癌放療敏感性，具有快速、簡潔、準確的優(yōu)點。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105400898
【申請?zhí)枴緾N201510989691
【發(fā)明人】孫建國, 陳旭, 徐燕梅, 張露萍, 李德志, 陳正堂
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月24日