血漿miRNA水平指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種血漿miRNA水平指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，其主要的病理類型為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。放射治療是肺癌的重要治療手段，據(jù)統(tǒng)計，60% -70%的NSCLC患者在疾病的不同階段需接受放射治療。
[0003]但即使是根治性放療也不能徹底消除腫瘤，常規(guī)分割放療(convent1nalfract1nated rad1therapy, CFRT)兩年復(fù)發(fā)率高達(dá)60%-70%，進(jìn)一步提高肺癌放療療效是目前需迫切解決的問題。輻射抵抗嚴(yán)重影響放療療效，放療前對患者輻射敏感程度進(jìn)行評估，有助于制訂最佳的放療計劃，提尚放療療效，但目如臨床缺之敏感、有效的療效預(yù)測指標(biāo)。
[0004]微小RNA (mi croRNA，mi RNA)是一類保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均起重要調(diào)控作用，最新研究發(fā)現(xiàn)，其與放化療抵抗、腫瘤干細(xì)胞特性維持、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransit1n, EMT)等生物學(xué)特征也密切相關(guān)。miRNA表達(dá)具有組織特異性，在血楽中可穩(wěn)定表達(dá)，并可進(jìn)行定量檢測分析，因此血漿miRNA有望成為肺癌放療療效預(yù)測的新型指標(biāo)。
[0005]相對而言，作為技術(shù)人員來說，開發(fā)一種血漿miRNA水平指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，設(shè)計合理，血漿miRNA可反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，檢測血漿miRNA表達(dá)水平，從而預(yù)測肺癌放療敏感性，具有快速、簡潔、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，對肺癌放療的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種血漿miRNA水平指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，設(shè)計合理，血漿miRNA可反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，檢測血漿miRNA表達(dá)水平，從而預(yù)測肺癌放療敏感性，具有快速、簡潔、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
[0007]為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0008]血漿miRNA水平指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，特征在于:
[0009](1)、抽取肺癌患者放療前外周血，提取血漿；
[0010](2)、分離純化血漿總RNA ；
[0011](3)、以cel-miR-39-3p (cel-39)作為外參照，與miR-18a_5p反轉(zhuǎn)錄引物一起進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
[0012](4)、加入miR-18a-5p PCR引物進(jìn)行10個循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增；
[0013](5)、加入cel-39引物與miR-18a_5p PCR引物，qPCR法檢測肺癌患者血漿miR-18a_5p 水平；
[0014](6)、miRNA 判讀標(biāo)準(zhǔn):miR-18a-5p/cel-39>2.28。
[0015]作為一種優(yōu)化的技術(shù)方案，步驟(2)分離純化血漿總RNA的方法如下:
[0016]1)取 200 μ 1 血漿于 1.5ml EP 管中；
[0017]2)向EP管中加入1000 μ 1 QIAzol Lysis Reagent裂解液，旋轉(zhuǎn)混勻；
[0018]3)室溫下放置5min;
[0019]4)加入200 μ 1三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混勻15s ；
[0020]5)室溫下放置2-3min ；
[0021]6)4°C，12000g 離心 15min ;
[0022]7)將上清液(600 μ 1)轉(zhuǎn)移到新1.5ml EP管中，加入900 μ 1無水乙醇；
[0023]8)將步驟 8 的混合液體 750 μ 1 加入 2ml RNeasy MinElute Spin Columns，室溫lOOOOrpm離心15s，棄下層液體；
[0024]9)重復(fù)步驟8)；
[0025]10)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 700 μ 1 RWT buffer, lOOOOrpm離心15s，棄下層液體；
[0026]11)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 RPE buffer, lOOOOrpm離心15s，棄下層液體；
[0027]12)向 2ml RNeasy MinElute Spin Columns 中加入 500 μ 1 80% 無水乙醇，lOOOOrpm離心2min，棄下層液體；
[0028]13)將洗脫膜植入新2ml收集管，最高速度離心5min ；
[0029]14)將洗脫膜植入新1.5ml收集管中，加入20 μ 1無酶水，最高速度離心lmin ；
[0030]15)離心后，收集管中即為總RNA ；
[0031]16)使用超微量分光光度計測量提取的總RNA濃度。
[0032]作為一種優(yōu)化的技術(shù)方案，步驟(3)反轉(zhuǎn)錄的方法是:
[0033]1)配置反轉(zhuǎn)錄液(20 μ 1):
[0034]5XPrimeScriptBuffer,4 μ 1 ；
[0035]PrimeScriptRT Enzyme Mix，1 μ 1 ；
[0036]miR-18a-5p 反轉(zhuǎn)錄引物(2 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0037]cel-39 反轉(zhuǎn)錄引物(2 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0038]cel-39standard(0.1 μ Μ)，1 μ 1 ；
[0039]總RNA(lOOng)，1 μ 1
[0040]無酶水，補(bǔ)足20 μ 1。
[0041]2)反應(yīng)條件:
[0042]Stepl:42°C, 15min ；
[0043]Step2:85°C，5s。
[0044]步驟(4)預(yù)擴(kuò)增方法是:
[0045]1)配制預(yù)擴(kuò)增液(12.5 μ 1)
[0046]cDNA，1 μ 1 ；
[0047]miR-18a-5p 上游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0048]miR-18a-5p 下游引物(10 μ Μ)，0.5 μ 1 ;
[0049]2 X Taq PCR MasterMix,6.25 μ 1 ；
[0050]無酶水，4.25μ1;
[0051 ]2)反應(yīng)條件(普通PCR儀)
[0052]Reps:94°C，3min ;
[0053]Reps:94°C，30s ;60°C，30s ；72°C, lmin ;lOcycles ；
[0054]Reps:72°C, 5min0
[0055]作為一種優(yōu)化的技術(shù)方案，步驟(5) qPCR方法是:
[0056]1)配制PCR反應(yīng)液(20 μ 1體系)
[0057]SYBRPremix Ex Taq II, 10 μ 1 ；
[0058]上游引物(10uM)，0.5 μ 1 ;
[0059]下游引物(10uM)，0.5 μ 1 ;
[0060]ROX II，0.4 μ 1 ;
[0061]預(yù)擴(kuò)增液，2μ1;
[0062]無酶水，6.6 μ 1 ;
[0063]2)反應(yīng)條件
[0064]Reps:95°C, 30s ；
[0065]Reps:95°C，5s ;60°C，34s ;40cycles。
[0066]作為一種優(yōu)化的技術(shù)方案，步驟￠)中判讀標(biāo)準(zhǔn):miR-18a-5p/cel-39>2.28。
[0067]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明該檢測技術(shù)中miR-18a_5p的敏感性和特異性分別87%和95%。miR-18a-5p/cel-39>2.28的患者，給予較低放療劑量(56-60Gy)，miR-18a-5p/cel-39彡2.28的患者，給予較高放療劑量(66_70Gy)。
[0068]本發(fā)明設(shè)計合理，血漿miR-18a_5p可反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，檢測血漿miR-18a-5p水平，預(yù)測肺癌患者放療敏感性，具有快速、簡潔、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0069]實(shí)施例:
[0070]血漿miRNA水平指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌適宜放療劑量的檢測技術(shù)，總的方法如下:
[0071](1)、抽取肺癌患者放療前外周血，提取血楽；
[0072](2)、分離純化血漿總RNA ；
[0073](3)、以cel-miR-39 (cel-39)作為外參照，與miR-18a_5p反轉(zhuǎn)錄引物一起進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
[0074](4)、加入miR-18a-5p PCR引物進(jìn)行10個循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增；
[0075](5)、加入cel-39引物與miR-18a_5p PCR引物，qPCR法檢測肺癌患者血漿miR-18a_5p 水平；
[0076](6)、miRNA 檢測標(biāo)準(zhǔn):miR-18a-5p/cel-39>2.28。
[0077]具體來說，步驟(2)分離純化血漿總RNA的方法是:
[0078]1)取 200 μ 1 血漿于 1.5ml EP 管中；
[0079]2)向EP管中加入1000 μ 1 QIAzol Lysis Reagent裂解液，旋轉(zhuǎn)混勾；
[0080]3)室溫下放置5min ；
[0081]4)加入200 μ 1三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混勻15s ；
[0082]5)室溫下放置2_3min ；
[0083]6) 4°C，12000g 離心 15min ；
[0084]7)將上清液(600 μ 1)轉(zhuǎn)移到新1.5ml EP管中，加入900 μ 1無水乙醇；
[0085]8)將步驟 8 的混合液體 750 μ 1 加入 2ml RNeasy MinElute Spin Columns，室溫lOOOOrpm離心15s，棄下層液體；
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