椎間盤(pán)退行性病變miRNA標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及miR-1288在診治椎間盤(pán)退行性病變中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] miRNA是天然存在于體內(nèi)的21-22nt的非編碼RNA分子，是一類(lèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因沉 默對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的RNA。據(jù)估計(jì)，生物體內(nèi)約有1/3的基因受miRNA的調(diào)控。miRNA 與RISC的復(fù)合體通過(guò)堿基配對(duì)可與靶基因 mRNA 5' -UTR或者3' -UTR中的互補(bǔ)序列相結(jié) 合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mRNA降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。
[0003] 檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平可以為疾病的臨床診斷提供參考。而miRNA的異常表達(dá)直 接導(dǎo)致一些與疾病發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)異常，誘發(fā)疾病的發(fā)生。已有報(bào)道證明miRNA可以 通過(guò)調(diào)控靶基因 mRNA的表達(dá)，在疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在未來(lái)臨床治療 中，miRNA不僅可以成為新的疾病早期診斷和疾病進(jìn)程相關(guān)的標(biāo)記物，而且也有望通過(guò)改變 miRNA的表達(dá)或者其靶基因的表達(dá)治療疾病。尋找和鑒定與疾病發(fā)生相關(guān)的miRNA及其靶 基因?yàn)閙iRNA的臨床治療提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種可用于早期診斷椎間盤(pán)退行性病變的微小RNA 標(biāo)記物。
[0005] 本發(fā)明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種微小RNA在制備椎間盤(pán)退行性病變?cè)\斷工具中的應(yīng)用，所述微 小RNA選自以下組：初始miRNA、前體miRNA、成熟miRNA ;初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切 并表達(dá)成成熟miRNA ;前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA ;所述微小RNA 是 miR-1288。
[0008] 應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的微小RNA包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其顯示 完整微小RNA核酸分子相同的功能，盡管它們通過(guò)核苷酸殘基的缺失、置換或者插入而突 變。
[0009] 本領(lǐng)域人員應(yīng)該了解，為了保證微小RNA的穩(wěn)定性，可以在微小RNA的一端或者兩 端增加保護(hù)性堿基，如TT，也可對(duì)微小RNA堿基進(jìn)行修飾，但是上述修飾不影響微小RNA的 功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在不影響miR-1288功能的條件下，對(duì)miR-1288進(jìn)行堿 基修飾或者在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體的實(shí)施方式中，所述miR-1288是成熟miR-1288。
[0011] 雖然在某些【具體實(shí)施方式】中所使用的是成熟miRNA，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù) 期，初始miRNA、前體miRNA將可以獲得與成熟miRNA同樣的技術(shù)效果，因?yàn)榧?xì)胞有能力進(jìn)一 步將初始miRNA、前體miRNA加工為成熟miRNA。
[0012] 本發(fā)明的微小RNA核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟miRNA主要呈單 鏈形式，而前體miRNA是部分自互補(bǔ)的，以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA、 DNA、PNA、LNA 的形式。
[0013] 進(jìn)一步，上述診斷工具包括但不限于，芯片、試劑盒、試紙、高通量測(cè)序平臺(tái)。所述 診斷工具包括用于檢測(cè)miR-1288的表達(dá)水平的試劑。
[0014] 進(jìn)一步，所述試劑盒包括針對(duì)miR-1288的引物和/或探針；所述芯片包括固相載 體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對(duì)應(yīng)于 miR-1288的部分或全部序列；所述試紙包括針對(duì)miR-1288的引物和/或探針；所述高通量 測(cè)序平臺(tái)包括針對(duì)miR-1288的引物和/或探針。
[0015] 本發(fā)明提供了 一種椎間盤(pán)退行性病變的診斷工具，所述診斷工具包括檢測(cè) miR-1288表達(dá)水平的試劑。
[0016] 進(jìn)一步，所述診斷工具包括試劑盒、芯片、試紙、高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0017] 進(jìn)一步，所述試劑盒包括針對(duì)miR-1288的引物和/或探針；所述芯片包括固相載 體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對(duì)應(yīng)于 miR-1288的部分或全部序列；所述試紙包括針對(duì)miR-1288的引物和/或探針；所述高通量 測(cè)序平臺(tái)包括針對(duì)miR-1288的引物和/或探針。
[0018] 進(jìn)一步，所述試劑盒中的針對(duì)miR-1288的引物和/或探針還可包括針對(duì)現(xiàn)有技術(shù) 中已經(jīng)報(bào)道的可用于檢測(cè)前面所述的微小RNA表達(dá)水平的引物和/或探針。將多種微小 RNA的檢測(cè)引物和/或探針?lè)胖迷谕辉噭┖兄型ㄟ^(guò)檢測(cè)多種微小RNA指標(biāo)聯(lián)合診斷椎間 盤(pán)退行性病變的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0019] 進(jìn)一步，所述芯片上固定的所述寡核苷酸探針還可包括針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道 的可用于檢測(cè)miR-1288的表達(dá)水平的寡核苷酸探針。將多種miRNA的檢測(cè)探針?lè)胖迷谕?一芯片上通過(guò)檢測(cè)多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷椎間盤(pán)退行性病變也包含在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0020] 進(jìn)一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料， 例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)（如醛基、氨基等）修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑 料片等。
[0021] 所述的miRNA芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法，例如， 如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡 核苷酸探針配制成溶液，然后采用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序 列或陣列，然后通過(guò)放置過(guò)夜來(lái)固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修飾，則其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》； J. L. erisi? V. R. Iyer? P. 0. BROWN. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science，1997 ;278 :680和馬立人，蔣中華主編·生 物芯片.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000,1-130。
[0022] 本發(fā)明的miR-1288可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá)miR-1288 的DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。
[0023] 病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）載體、甲病毒載 體。
[0024] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3. 0表達(dá)載體、pcDNA3. 1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表 達(dá)載體、PTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0025] 可以表達(dá)微小RNA的DNA片段可以通過(guò)如下方式獲?。簭膍iRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中 (http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)尋找微小RNA在基因組上的位置及具體序 列信息，根據(jù)基因組序列確定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp區(qū) 間內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增引物中間的序列即可獲得表達(dá)微小RNA的DNA片段。
[0026] 藥物篩選：在得知了前面所述的miR-1288與椎間盤(pán)退行性病變的密切相關(guān)性后， 可以基于該特征來(lái)篩選促進(jìn)miR-1288表達(dá)的物質(zhì)。之后，可從所述的物質(zhì)中找到對(duì)于治療 椎間盤(pán)退行性病變真正有用的藥物。
[0027] 因此，本發(fā)明還提供了一種篩選治療椎間盤(pán)退行性病變的潛在物質(zhì)的方法，所述 的方法包括：用候選物質(zhì)處理椎間盤(pán)退行性病變相關(guān)細(xì)胞體系，若所述候選物質(zhì)可促進(jìn)前 面所述的miR-1288的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是治療椎間盤(pán)退行性病變的潛在物 質(zhì)。所述細(xì)胞體系可以是亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系（如動(dòng)物 模型，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物的動(dòng)物模型，如鼠、兔、羊、猴等）等。優(yōu)選地，對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn) 行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于治療椎間盤(pán)退行性病變真 正有用的物質(zhì)。
[0028] 本發(fā)明還提供了 miR-1288在制備治療椎間盤(pán)退行性病變的藥物中的應(yīng)用。
[0029] 進(jìn)一步，所述藥物組合物包括有效劑量的抑制劑。所述抑制劑能夠抑制miR-1288 的表達(dá)、或能夠抑制miR-1288的活性、或能夠縮短miR-1288的有效作用時(shí)間、或能夠抑制 miR-1288的穩(wěn)定性。所述抑制劑的靶標(biāo)不限于miR-1288本身，還包括miR-1288的上下游， 例如：編碼miR-1288的基因組序列，miR-1288的靶基因、調(diào)控miR-1288的蛋白或者基因。
[0030] 進(jìn)一步，miR-1288抑制劑包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表達(dá)載體。
[0031] 所述用于寡核苷酸表達(dá)的載體包括病毒載體、真核載體。
[0032] 病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）載體、甲病毒載 體。
[0033] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3. 0表達(dá)載體、pcDNA3. 1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表 達(dá)載體、PTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0034] 優(yōu)選地，所述miR-1288抑制劑是miRNA-1288的反義寡核苷酸（anti-miR-1288) 或者miRNA-1288模擬物。
[0035] 根據(jù)miRNA-1288序列容易設(shè)計(jì)出它的反義寡核苷酸，將反義寡核苷 酸轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)后，它們能夠明顯下調(diào)miRNA-1288的表達(dá)。"反義寡核苷酸 (antisense-oligonucleotides，AS-