修飾的膠原蛋白分子的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年5月9日提交的新加坡申請(qǐng)?zhí)?01303597-7的優(yōu)先權(quán)權(quán)益， 該申請(qǐng)的內(nèi)容整體地通過(guò)引用合并于此用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于生物材料及其合成分領(lǐng)域，具體地，膠原蛋白分子的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0004] 生物材料是能夠在生物學(xué)系統(tǒng)中交互作用的天然或合成材料。生物材料的重要應(yīng) 用是用于組織工程的支架。最常見(jiàn)的支架之一是基于膠原蛋白的支架。
[0005] 膠原蛋白是哺乳動(dòng)物組織中的主要結(jié)構(gòu)成分，并介導(dǎo)大量的生物學(xué)過(guò)程。其獨(dú)特 的分級(jí)自組裝性質(zhì)，以及體內(nèi)的高豐度，使得其成為了仿生學(xué)領(lǐng)域中有吸引力的支架。除了 膠原蛋白以外，糖胺聚糖（GAG)也充當(dāng)組織中必不可少的成分。這些高度帶負(fù)電荷的大分 子調(diào)節(jié)許多重要的生理過(guò)程和基于膠原蛋白的支架的機(jī)械特性。然而，來(lái)源于天然材料的 膠原蛋白-GAG復(fù)合材料具有缺點(diǎn)。例如，與天然材料相關(guān)聯(lián)的免疫原性、批次間變異、和復(fù) 雜的純化。這些缺點(diǎn)已經(jīng)阻礙了產(chǎn)生用于工程化細(xì)胞外環(huán)境的明確的分子工具的努力。
[0006] 因此本發(fā)明尋求提供改進(jìn)的膠原蛋白-支架。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在第一個(gè)方面，提供了一種膠原蛋白分子，其包含三條鏈，其中至少一條鏈包含至 少一個(gè)具有下式的重復(fù)單元：
[0008] (Xl-X2-G)n ；
[0009] 其中Xl或X2可以是任意氨基酸或氨基酸衍生物，前提條件是Xl或X2中的至少 一個(gè)是糖胺聚糖配基；
[0010] G是甘氨酸；且
[0011] η為正整數(shù)且為至少1。
[0012] 在第二個(gè)方面，提供了如本文所定義的膠原蛋白分子，其用在療法中。
[0013] 在第三個(gè)方面，提供了一種治療需要療法的患者的方法，包括施用如本文所定義 的膠原蛋白分子。
[0014] 在第四個(gè)方面，提供了如本文所定義的膠原蛋白分子，其用于化妝品中。
[0015] 在第五個(gè)方面，提供了如本文所定義的膠原蛋白分子，其用于組織工程中。
[0016] 在第六個(gè)方面，提供了如本文所定義的膠原蛋白分子，其用于構(gòu)建支架中。
[0017] 在第七個(gè)方面，提供了一種組合物，其包含如本文所定義的膠原蛋白分子和一種 或多種賦形劑。
[0018] 在第八個(gè)方面，提供了如本文所定義的膠原蛋白分子，其用于基于糖胺聚糖的藥 物中。
[0019] 在第九個(gè)方面，提供了如本文所定義的膠原蛋白分子，其用作用于組織工程的生 物材料。
[0020] 在第十個(gè)方面，提供了如本文所定義的膠原蛋白分子，其用于藥物遞送或傷口愈 合中。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 結(jié)合非限制性實(shí)施例和附圖考慮，參照【具體實(shí)施方式】，將更好地理解本發(fā)明，在附 圖中：
[0022] 圖1由圖IA和IB構(gòu)成，顯示了本文公開(kāi)的膠原蛋白分子的示意性實(shí)施例。圖IA 顯示了具有三條鏈的膠原蛋白分子的示意性圖示，其中一條鏈包含重復(fù)單元。圖IB顯示了 具有三條鏈的膠原蛋白分子的示意性圖示，其中兩條鏈或三條鏈包含重復(fù)單元。圖1圖示 了在一條鏈內(nèi)或鏈間，重復(fù)單元可以是相同的或不同的。圖1還圖示了在指定的鏈內(nèi)或鏈 間，重復(fù)單元可以重復(fù)相同或不同的次數(shù)。
[0023] 圖2由圖2A和2B構(gòu)成。圖2A顯示本領(lǐng)域已知的膠原蛋白-GAG肽的示意性圖 示。圖2B顯示本發(fā)明的膠原蛋白-GAG肽的示意性圖示。如圖2中顯示的GAG配基可以是 任意的GAG配基。圖2中顯示的氨基酸或氨基酸衍生物可以是任意氨基酸或任意氨基酸衍 生物。
[0024] 圖3顯示異質(zhì)GAG配基鏈和如本文公開(kāi)的包含同質(zhì)GAG配基的同質(zhì)膠原蛋白鏈之 間的差異。
[0025] 圖4顯示可以在本發(fā)明中使用的多種GAG配基的實(shí)施例。
[0026] 圖5由圖5A和5B構(gòu)成。圖5A顯示在膠原蛋白模擬肽中CS-A二糖和帶正電荷的 氨基酸之間的靜電相互作用的示意性圖示。圖5B顯示使用的肽的結(jié)構(gòu)。
[0027] 圖6由圖6A-6F構(gòu)成。圖6A顯示肽1的⑶光譜。圖6B顯示肽2和3的⑶光譜。 圖6C和6D顯示肽1 · 2的1:2混合物的相對(duì)于溫度的熱變性曲線和一階導(dǎo)數(shù)作圖。圖6E 和6F顯示肽1 · 3的1:2混合物的相對(duì)于溫度的熱變性曲線和一階導(dǎo)數(shù)作圖。
[0028] 圖7由圖7A和7B構(gòu)成，并且顯示了肽1 · 2(圖7A)和肽1 · 3(圖7B)的1:2混 合物的CD光譜。
[0029] 圖8由圖8A-8D構(gòu)成，并且顯示了肽4(圖8A)、肽1 · 4的1:2混合物（圖8B)、 CS-A二糖和肽4的4:1混合物（圖8C)的1H、15N-HSQC光譜，肽1 · 3的1:2退火混合物的 DSC解鏈曲線圖（圖8D)。
[0030] 圖9由圖9A-9B構(gòu)成，并且顯示了 CS-A二糖和肽4的4:1混合物（圖9A)、10:1 混合物（圖9B)的1H、15N-HSQC光譜。
[0031] 圖10顯示了肽1的分析性HPLC跡線（頂部）和ESI質(zhì)量數(shù)據(jù)（底部）。
[0032] 圖11顯示了肽2的分析性HPLC跡線（頂部）和ESI質(zhì)量數(shù)據(jù)（底部）。
[0033] 圖12顯示了肽3的分析性HPLC跡線（頂部）和ESI質(zhì)量數(shù)據(jù)（底部）。
[0034] 圖13顯示了肽4的分析性HPLC跡線（頂部）和ESI質(zhì)量數(shù)據(jù)（底部）。
[0035] 圖14顯示了肽5的分析性HPLC跡線（頂部）和ESI質(zhì)量數(shù)據(jù)（底部）。
[0036] 圖15顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，從三氯乙酰亞胺酯4轉(zhuǎn)化后，完全保護(hù)的二糖5的 1H NMR光譜。
[0037] 圖16顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，從三氯乙酰亞胺酯4轉(zhuǎn)化后，完全保護(hù)的二糖5的 13C NMR光譜。
[0038] 圖17顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方法 的一個(gè)實(shí)施方案中，用η-三丁基錫烷和AIBN將N-三氯乙?；?jīng)自由基介導(dǎo)還原為N-乙 ?；?lèi)物后，乙酰胺6的 1H NMR譜。
[0039] 圖18顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方法 的一個(gè)實(shí)施方案中，用η-三丁基錫烷和AIBN將N-三氯乙?；?jīng)自由基介導(dǎo)還原為N-乙 ?；?lèi)物后，乙酰胺6的 13C NMR譜。
[0040] 圖19顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，在水解6的亞芐基乙縮醛，接著去除TMS基團(tuán)后，二醇7的 1H NMR譜。
[0041] 圖20顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方法 的一個(gè)實(shí)施方案中，在水解6的亞芐基乙縮醛，接著去除TMS基團(tuán)后，二醇7的 13C NMR譜。
[0042] 圖21顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，在選擇性苯甲酰化二醇7的C6羥基后，二糖8的 1H NMR譜。
[0043] 圖22顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，在選擇性苯甲酰化二醇7的C6羥基后，二糖8的 13C NMR譜。
[0044] 圖23顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，在用SO 3 ?三甲胺復(fù)合物處理8后，硫酸化二糖基序的1H NMR譜。
[0045] 圖24顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，在用SO 3 ?三甲胺復(fù)合物處理8后，硫酸化二糖基序的13C NMR譜。
[0046] 圖25顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，在LiOOH和NaOH的相繼處理后，所需CS-A二糖9的 1H NMR譜。
[0047] 圖26顯示了在如方案1中所繪合成如上所定義的含有GAG的膠原蛋白肽1的方 法的一個(gè)實(shí)施方案中，在LiOOH和NaOH的相繼處理后，所需CS-A二糖9的 13C NMR譜。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 膠原蛋白是哺乳動(dòng)物組織中介導(dǎo)許多生物學(xué)過(guò)程的主要結(jié)構(gòu)成分。目前，已知有 28種不同類(lèi)型的膠原蛋白，這些類(lèi)型的實(shí)例包括但不限于I型膠原蛋白、II型膠原蛋白、 III型膠原蛋白、IV型膠原蛋白和V型膠原蛋白。在這些類(lèi)型中，I型膠原蛋白在身體中最 豐富并且見(jiàn)于皮膚中。I型膠原蛋白也是組織工程中最常使用的膠原蛋白。天然存在的膠 原蛋白具有由三個(gè)蛋白股或三條蛋白鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是不 同類(lèi)型的膠原蛋白由不同類(lèi)型的蛋白鏈組成。例如，I型、IV型和VIII型膠原蛋白由兩條 a 1鏈和一條α 2鏈構(gòu)成，II型、II VII型和X型膠原蛋白由三條a 1鏈構(gòu)成，VI型膠原 蛋白由一條α 1、一條α 2和一條α 3鏈構(gòu)成。如本文所公開(kāi)的膠原蛋白分子的修飾可以對(duì) 膠原蛋白分子的一股或多股進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)例中，VI型膠原蛋白的一條α?鏈被修飾。在 另一個(gè)實(shí)例中，X型膠原蛋白的兩條α 1鏈被修飾。
[0049] 本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是膠原蛋白的一個(gè)區(qū)別性特征是在膠原蛋白分子的每 條鏈或每股中存在氨基酸的重復(fù)單元。這種重復(fù)的氨基酸單元是Gly-Pro-X或Gly-X-Hyp, 其中X是任意氨基酸，且Hyp是脯氨酸的衍生物，羥基脯氨酸。
[0050] 膠原蛋白分子可以被修飾或合成以賦予所需的特性諸如穩(wěn)定性、在膠原蛋白分子 的一股上的總電荷以及與其他分子的相互作用。
[0051] 因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種膠原蛋白分子，包含三條鏈，其中至少一 條鏈包含至少一個(gè)具有下面通式的重復(fù)單元：
[0052] (Xl-X2-G)n ；
[0053] 其中Xl或X2可以是任意氨基酸或氨基酸衍生物，前提條件是Xl或X2中的至少 一個(gè)是糖胺聚糖配基；
[0054] G是甘氨酸；且
[0055] η為正整數(shù)且為至少1。
[0056] 例如，η可以是至少2、至少5、至少10、至少20、至少50、至少100、至少200、至少 500或至少1000。在一個(gè)實(shí)例中，η為1-10、2-5、2-4或10-50。在一個(gè)實(shí)例中，η是4。包 含上述值中的任一個(gè)的任何范圍也是可能的。因此，通常將理解η不存在上限。
[0057] 當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是指帶電荷的、不帶電荷的、極性的、非極性的、 芳族的、非芳族的氨基酸并且可以包括天然存在的氨基酸以及非天然存在的氨基酸。天然 存在的氨基酸、標(biāo)準(zhǔn)的或典型的氨基酸是指蛋白氨基酸。這些氨基酸的實(shí)例包括但不限于 20種必需氨基酸諸如，脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸、酪 氨酸和天冬酰胺。非天然存在的氨基酸、非典型氨基酸或非天然氨基酸的實(shí)例是指20種 必需氨基酸以外的氨基酸，包括但不限于非蛋白氨基酸、N-甲基氨基酸、D-氨基酸、二氨基 酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、甘氨酸衍生物和已經(jīng)被修飾的氨基酸。
[0058] 當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"氨基酸衍生物"是指已經(jīng)通過(guò)添加或去除一個(gè)或多個(gè)官 能團(tuán)而修飾的氨基酸或其手性已經(jīng)被修飾的氨基酸。氨基酸衍生物的實(shí)例包括但不限于羥 基脯氨酸和被保護(hù)的氨基酸諸如Fmoc和Boc保護(hù)的氨基酸。
[0059] 在本文公開(kāi)的膠原蛋白分子的一個(gè)實(shí)例中，膠原蛋白分子具有三條鏈，其中所述 至少一個(gè)重復(fù)單元處于一條鏈中。要理解包含重復(fù)單元的鏈的剩余部分由氨基酸或氨基酸 衍生物構(gòu)成。還要理解剩余的鏈僅由氨基酸、氨基酸衍生物或它們的混合物構(gòu)成。在本文 公開(kāi)的膠原蛋白分子的另一實(shí)例中，膠原蛋白分子具有三條鏈，其中至少一個(gè)重復(fù)單元處 于兩條鏈中。要理解包含重復(fù)單元的鏈的剩余部分由氨基酸或氨基酸衍生物構(gòu)成。還要理 解剩余的鏈僅由氨基酸、氨基酸衍生物或它們的混合物構(gòu)成。還在本文公開(kāi)的膠原蛋白分 子的另一實(shí)例中，膠原蛋白分子具有三條鏈，其中至少一個(gè)重復(fù)單元處于所有三條鏈中。要 理解鏈的剩余部分由氨基酸或氨基酸衍生物構(gòu)成。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的是 鏈內(nèi)的重復(fù)單元可以是不同的或者η可以是不同的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還很容易理解的是在 鏈間重復(fù)單元可以是不同的或在鏈間η可以是不同的。例如，在一個(gè)膠原蛋白分子的任意 指定鏈中，一個(gè)重復(fù)單元可以重復(fù)5次，而不同的重復(fù)單元可以重復(fù)10次，而在同一分子的 第二條鏈中第一重復(fù)單元或另一個(gè)重復(fù)單元可以重復(fù)20次，并且第三條鏈僅由氨基酸或 氨基酸衍生物構(gòu)成。
[0060] 出于清楚的緣故，本文公開(kāi)的膠原蛋白分子的實(shí)例示例性地呈現(xiàn)于圖1中。圖IA 顯示了本文公開(kāi)的其中所述至少一個(gè)重復(fù)單元在一條鏈上的膠原蛋白分子的實(shí)例。從圖IA 將理解重復(fù)單元可以是相同的或不同的，并且η可以是相同的或不同的。圖IB顯示了本文 公開(kāi)的其中所述至少一個(gè)重復(fù)單元在兩條鏈或三條鏈上的膠原蛋白分子的實(shí)例。將理解的 是在鏈間重復(fù)單元可以是相同的或不同的。還將理解的是在鏈間η可以是相同的或不同 的。將理解圖1代表了本文公開(kāi)的膠原蛋白分子的實(shí)例，并且不以任何方式限制要求保護(hù) 的分子的范圍。當(dāng)在本文中使用時(shí)，膠原蛋白可以是天然膠原蛋白或膠凝的膠原蛋白。膠 凝的膠原蛋白是指已經(jīng)變性的膠原