專利名稱：MHC Ⅱ類分子提呈的存活蛋白(Survivin)的部分肽及其利用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠用于癌免疫療法的抗原性多肽、和含有該多肽的惡性腫瘤治療 劑。
背景技術(shù)：
作為難以醫(yī)治的疾病-癌癥(惡性腫瘤)的治療方法之一，可列舉利用患者個(gè)體 所具有的免疫系統(tǒng)使癌細(xì)胞萎縮的、所謂癌免疫療法。該方法的重點(diǎn)在于，如何使免疫系統(tǒng) 識(shí)別癌細(xì)胞并將其作為異物、誘導(dǎo)出對(duì)癌細(xì)胞具有攻擊性的免疫細(xì)胞。參與抗腫瘤免疫的重要免疫細(xì)胞包括表達(dá)細(xì)胞表面蛋白CD8的細(xì)胞毒性性細(xì)胞 (⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞)、表達(dá)細(xì)胞表面蛋白⑶4的T細(xì)胞(⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞)。⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞 被活化時(shí)，將提呈與HLAI類分子結(jié)合的抗原的細(xì)胞溶解。CD4陽(yáng)性T細(xì)胞為分泌細(xì)胞因子 的Th細(xì)胞，被通過(guò)HLAII類分子提呈抗原的巨噬細(xì)胞和/或樹突狀細(xì)胞等活化，對(duì)誘導(dǎo)和 維持CD8陽(yáng)性T細(xì)胞發(fā)揮輔助功能。此外，已知Th細(xì)胞根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子的種類而分成Thl細(xì)胞(產(chǎn)生IFN- γ 等)、Th2細(xì)胞(產(chǎn)生IL-4等)和ThO細(xì)胞(產(chǎn)生細(xì)胞因子能力低或同時(shí)產(chǎn)生IFN-Y、IL-4 等)，各細(xì)胞的作用正不斷地得到闡明。此外，CD4陽(yáng)性T細(xì)胞通過(guò)針對(duì)MHC II類分子陰性 腫瘤(MHC II類-腫瘤)的間接機(jī)制、如介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，或者通過(guò)針對(duì)MHC II類陽(yáng) 性腫瘤的直接機(jī)制，從而也能夠具有效應(yīng)功能。迄今為止，人的癌免疫治療中的T細(xì)胞研究主要聚焦于⑶8陽(yáng)性HLAI類限制性 CTL應(yīng)答(CD8+HLA class I restricted CTL response)的鑒定和誘導(dǎo)(專利文獻(xiàn) 1)。CD4 陽(yáng)性T細(xì)胞方面，報(bào)道了癌抗原之一的酪氨酸酶及其對(duì)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的表位的鑒定以及 幾個(gè)表位(專利文獻(xiàn)2)，但其數(shù)量明顯少于CD8陽(yáng)性HLA I類限制性肽的報(bào)告例。此外，已經(jīng)報(bào)道的酪氨酸酶在黑素細(xì)胞系列的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，是與 被視為CD4陽(yáng)性黑素瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的特異性靶標(biāo)的MHC II類分子結(jié)合的唯一黑素瘤締 合性組織特異性抗原(非專利文獻(xiàn)1)。然而，酪氨酸酶為僅在有限類型的腫瘤中表達(dá)的抗 原，很難稱其為癌免疫治療中有希望的癌抗原。最近，報(bào)道了一種基因，其編碼被稱為存活蛋白(Survivin)的、被⑶8陽(yáng)性T細(xì)胞 識(shí)別的腫瘤特異性抗原(非專利文獻(xiàn)2)。存活蛋白被鑒定為具有抑制凋亡作用的物質(zhì)，是 共由142個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，其顯著特征為，存活蛋白在正常組織中限于 胎兒組織、成人中的胸腺和精巢等組織表達(dá)，在腫瘤組織尤其是癌變的肺、結(jié)腸、乳腺、脾、 前列腺和淋巴瘤等中表達(dá)增加(非專利文獻(xiàn)2)。還有報(bào)道指出，存活蛋白的表達(dá)增加與腫瘤性疾患的予后不良相關(guān)，認(rèn)為該蛋白 質(zhì)作為腫瘤抗原顯示出非常重要的作用，存活蛋白中的MHC II類限制性肽的鑒定正在進(jìn)行 (非專利文獻(xiàn)3)。然而，非專利文獻(xiàn)3中報(bào)告的肽所限制的HLA II類針對(duì)有限的HLA型， 為適應(yīng)臨床，需要使用適應(yīng)多種HLA型的多種肽。
3
非專利文獻(xiàn)1 :Topalian、S. L.等、1994 年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第 91 卷、第 9461-9465 頁(yè)非專利文獻(xiàn)2 =Chiara Casati 等、CANCER RESEARCH,2003 年、第 63 號(hào)、第 4507-4515 頁(yè)非專利文獻(xiàn)3 :Matthias Piesche 等、Human Immunology、2007 年、第 68 卷、第 572-576 頁(yè)專利文獻(xiàn)1 :W095/19783號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :W097/11669號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明提供新的腫瘤抗原、和在利用該腫瘤抗原治療惡性腫瘤的方法中有用的新 的治療劑以及能夠用于該治療劑的腫瘤抗原。解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有腫瘤抗原、和對(duì)該腫瘤抗原特異性的Th細(xì)胞的治 療劑具有能夠使表達(dá)該腫瘤抗原的惡性腫瘤顯著萎縮的效果；進(jìn)一步，確定了能夠用作該 腫瘤抗原的新的抗原性肽，從而完成了下述各發(fā)明。(1) 一種多肽，其由下述的a) g)中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，且具有使對(duì)存 活蛋白特異性的Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性，a)序列號(hào)17所示的氨基酸序列；b)在序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加1 數(shù)十個(gè)任意的 氨基酸而成的氨基酸序列；c)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端的1 4個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；d)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的C末端的1 5個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；e)序列號(hào)17所示的氨基酸序列中的1 數(shù)個(gè)氨基酸殘基被置換和/或缺失的氨 基酸序列；f)在序列號(hào)17所示的氨基酸序列中的1 數(shù)個(gè)氨基酸殘基被置換和/或缺失的 氨基酸序列的N末端和/或C末端，添加1 數(shù)十個(gè)任意的氨基酸而成的氨基酸序列；g)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端的1 5個(gè)氨基酸缺失的 氨基酸序列中進(jìn)一步置換了1 數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。(2)根據(jù)⑴所述的多肽，b) g)的氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有由序列號(hào)17所 示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽所具有的表位，該表位由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)存活蛋白特異 性的Th細(xì)胞。(3)編碼(1)或⑵所述的多肽的核酸。(4)含有(3)所述的核酸的載體。(5)與⑴或⑵所述的多肽特異性結(jié)合的抗體。(6) 一種惡性腫瘤免疫治療用疫苗，其含有(1)或(2)所述的多肽中的至少一種以 上作為有效成分。(7) 一種誘導(dǎo)對(duì)存活蛋白特異性的Th細(xì)胞的方法，所述方法包括在體外孵育(1)
4或(2)所述的多肽中的至少一種以上、抗原提呈細(xì)胞和CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的工序。(8) 一種惡性腫瘤治療劑，其含有⑴或(2)所述的多肽、以及對(duì)該多肽或存活蛋 白特異性的Th細(xì)胞。發(fā)明效果本發(fā)明的肽通過(guò)與抗原提呈細(xì)胞和⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞一起孵育，誘導(dǎo)對(duì)存活蛋白特 異性的Th細(xì)胞(以下表示為Sur/Th細(xì)胞)；此外，具有使該Sur/Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的 活性。該Sur/Th細(xì)胞特異性攻擊表達(dá)存活蛋白的惡性腫瘤，因而本發(fā)明的肽能夠用作惡性 腫瘤治療劑的成分。此外，本發(fā)明的多肽，其組成氨基酸殘基數(shù)少，并不限于通過(guò)基因重組法制備，也 能通過(guò)有機(jī)合成的方法大量制造，因而在臨床研究或臨床應(yīng)用中，能夠穩(wěn)定且廉價(jià)地供給。此外，含有本發(fā)明的多肽的惡性腫瘤治療劑通過(guò)將腫瘤抗原與對(duì)該腫瘤抗原特異 性的Th細(xì)胞組合，能夠更強(qiáng)烈地促進(jìn)Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。所產(chǎn)生的細(xì)胞因子在生物體 內(nèi)針對(duì)表達(dá)該腫瘤抗原的惡性腫瘤引發(fā)特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤萎縮。


圖1是細(xì)胞內(nèi)染色結(jié)果的圖，其表示的是對(duì)含有由HLA的基因型為 HLA-DRB 1*0101 /HLA-DRB1 *0901的人誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞的細(xì)胞群，分別添加混合肽 MIXl MIX5時(shí)，對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN-Y的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖中，縱軸表示⑶4的 表達(dá)強(qiáng)度，橫軸表示IFN-Y的表達(dá)強(qiáng)度。圖2是細(xì)胞內(nèi)染色結(jié)果的圖，其表示的是對(duì)含有由HLA的基因型為 HLA-DRB 1*0101 /HLA-DRB1 *0901的人誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞的細(xì)胞群，分別添加多肽SU16 SU22時(shí)，對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN-γ的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖中，縱軸表示⑶4的表達(dá)強(qiáng) 度，橫軸表示IFN-Y的表達(dá)強(qiáng)度。圖3表示的是對(duì)含有由HLA的基因型為HLA-DRB 1*0101/HLA-DRB 1*0901的人 誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞的細(xì)胞群，分別添加抗HLA-DP抗體、抗HLA-DQ抗體和抗HLA-DR 抗體時(shí)，通過(guò)ELISA對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN-Y的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖中，縱軸表示 IFN-y (IFN-g)的產(chǎn)生量。圖4表示的是對(duì)含有由HLA的基因型為HLA-DRB 1*0101/HLA-DRB 1*0901的人誘 導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞的細(xì)胞群、和對(duì)HLA的基因型分別為HLA-DRB1*1201/HLA_DRB1*1405、 HLA-DRB1 *0410/HLA-DRB 1*1201, HLA-DRB1*0405/HLA_DRB1*0901、HLA_DRB1*0401/ HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0802 和 HLA-DRB1*0101/HLA_DRB1*0101 的異基 因的PBMC，分別添加SU18(congnate)和對(duì)照肽(irrelevant)時(shí)，通過(guò)ELISA對(duì)Sur/Th細(xì)胞 的IFN-Y的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖中，縱軸表示HLA的基因型，橫軸表示IFN-Y (IFN-g) 的產(chǎn)生量。圖5表示的是對(duì)由HLA的基因型為HLA-DRB1*0101的人誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞， 分別添加多肽Tl Tll時(shí)，通過(guò)ELISA對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN- γ的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。 圖中，縱軸表示HLA的基因型，橫軸表示IFN-Y (IFN-g)的產(chǎn)生量。圖6為ELISPOTassay圖，其表示的是對(duì)由HLA的基因型為HLA_DRB1*1201/ HLA-DRB1*1502的人誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞，分別添加多肽Tl TlO時(shí)，測(cè)定產(chǎn)生IFN-γ的Sur/Th細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的結(jié)果。圖7表示的是對(duì)含有由HLA的基因型為HLA-DQB1*0302/HLA_DQB1*0601的人 誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞的細(xì)胞群，分別添加抗HLA-DP抗體、抗HLA-DQ抗體和抗HLA-DR 抗體時(shí)，通過(guò)ELISA對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN-Y的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖中，縱軸表示 IFN-y (IFN-g)的產(chǎn)生量。圖8表示的是對(duì)含有由HLA的基因型為HLA-DQB1*0302/HLA_DQB1*0601的人誘 導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞的細(xì)胞群、和對(duì)HLA的基因型分別為HLA-DQB1*0301/HLA_DQB1*0302、 HLA-DQBl氺0401/HLA-DQB1 氺0602、HLA—DQB1 氺0302/HLA—DQB1 氺0401 禾口 HLA—DQB1 氺0301/ HLA-DQB 1*0601的異基因的PBMC，分別添加SU18 (congnate)和對(duì)照肽(irrelevant)時(shí)，通 過(guò)ELISA對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN- γ的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。圖中，縱軸表示HLA的基因型， 橫軸表示IFN-Y (IFN-g)的產(chǎn)生量。圖9表示的是對(duì)由HLA的基因型為HLA-DQB 1*0601的人誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞， 分別添加多肽Tl TlO時(shí)，通過(guò)ELISA對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN- γ的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。 圖中，縱軸表示HLA的基因型，橫軸表示IFN-Y (IFN-g)的產(chǎn)生量。圖10表示的是對(duì)由HLA的基因型為HLA_DQB1*0601的人誘導(dǎo)出的Sur/Th細(xì)胞， 分別添加多肽Sl S17時(shí)，通過(guò)ELISA對(duì)Sur/Th細(xì)胞的IFN- γ的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。 圖中，縱軸表示HLA的基因型，橫軸表示IFN-Y (IFN-g)的產(chǎn)生量。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及存活蛋白的部分多肽、含有該部分多肽的腫瘤抗原、以及含有該腫瘤 抗原和對(duì)該腫瘤抗原特異性的Th細(xì)胞的惡性腫瘤治療劑。本發(fā)明的惡性腫瘤治療劑，優(yōu)選 含有含有存活蛋白的部分多肽的腫瘤抗原、以及通過(guò)該腫瘤抗原由自治療對(duì)象患者回收 的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)的對(duì)該腫瘤抗原特異性的Th細(xì)胞。本發(fā)明的惡性腫瘤治療劑由作為存活蛋白的部分多肽的腫瘤抗原和對(duì)該腫瘤抗 原特異性的Th細(xì)胞組合而成，通過(guò)采取該構(gòu)成，與對(duì)患者分別單獨(dú)投與該腫瘤抗原或?qū)υ?腫瘤抗原特異性的Th細(xì)胞時(shí)相比，在惡性腫瘤的萎縮作用中具有顯著效果。對(duì)含有存活蛋白的部分多肽的腫瘤抗原特異性的Th細(xì)胞是指，受該腫瘤抗原特 異性刺激而產(chǎn)生細(xì)胞因子的Th細(xì)胞，可以是ThO細(xì)胞、Thl細(xì)胞、Th2細(xì)胞中的任意一種， Thl細(xì)胞更適合。所述對(duì)腫瘤抗原特異性的Th細(xì)胞可通過(guò)在適當(dāng)條件下孵育該腫瘤抗原、 表達(dá)HLA II類分子的抗原提呈細(xì)胞和⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞而由該⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)制得。本發(fā)明的方法中能夠利用的⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞可由采集的血液通過(guò)常規(guī)方法、例如 使用MACS (Mi ltenyi Biotech公司)等的方法而分離出。本發(fā)明中，優(yōu)選的是，利用從作為 治療對(duì)象的具有惡性腫瘤的患者回收的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞。本發(fā)明的方法中能夠利用的抗原提呈細(xì)胞只要是在表面表達(dá)HLA II類分子的細(xì) 胞即可，除樹突狀細(xì)胞外還可列舉出B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、非增殖性的轉(zhuǎn)染子等，但 并不限于此。孵育既可以是同時(shí)對(duì)含有存活蛋白的部分多肽的腫瘤抗原、抗原提呈細(xì)胞和CD4 陽(yáng)性T細(xì)胞進(jìn)行孵育；或者也可以是先孵育該腫瘤抗原和抗原提呈細(xì)胞，然后在CD4陽(yáng)性T 細(xì)胞共存下進(jìn)行孵育。孵育的條件，可以是按照常規(guī)方法、例如Tim等(Immimology Today,1996年、第17卷、第3號(hào)、第138-146頁(yè))所述的方法，即，在IL-2的存在下，在HLA II類 分子的介導(dǎo)下抗原提呈細(xì)胞提呈所需的抗原，由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)該抗原特異性的成 熟Th細(xì)胞。此外，可基于西村等(J.Exp. Med.、1999年、第190卷、第5號(hào)、第617-627頁(yè)) 的記載對(duì)孵育的各種條件進(jìn)行各種變更，能夠由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞特異性誘導(dǎo)ThO細(xì)胞、Thl 細(xì)胞、或Th2細(xì)胞中的任意一種。通過(guò)用作為存活蛋白的部分多肽的腫瘤抗原再刺激時(shí)，對(duì)此時(shí)產(chǎn)生的各細(xì)胞的細(xì) 胞因子(例如前述的Tim等)進(jìn)行確認(rèn)，可知ThO細(xì)胞、Thl細(xì)胞、或Th2細(xì)胞被誘導(dǎo)出來(lái)。 確認(rèn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生可利用ELISA法、細(xì)胞內(nèi)染色法、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)法、以及其 它各種方法。本發(fā)明的多肽的一個(gè)方式，為相當(dāng)于被稱為存活蛋白的腫瘤抗原蛋白(前述非專 利文獻(xiàn)2)的第76 94位的氨基酸序列(序列號(hào)17，以下稱為SU18)的抗原性多肽。進(jìn)一步，與SU18(序列號(hào)17)的多肽的氨基酸序列存在以下的b) g)的關(guān)系的 氨基酸序列所構(gòu)成的多肽也可用作本發(fā)明的腫瘤抗原。b)在序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加1 數(shù)十個(gè)任意的 氨基酸而成的氨基酸序列；c)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端的1 4個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；d)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的C末端的1 5個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；e)序列號(hào)17所示的氨基酸序列中的1 數(shù)個(gè)氨基酸殘基被置換和/或缺失的氨 基酸序列；f)在序列號(hào)17所示的氨基酸序列中的1 數(shù)個(gè)氨基酸殘基被置換和/或缺失的 氨基酸序列的N末端和/或C末端，添加1 數(shù)十個(gè)任意的氨基酸而成的氨基酸序列；g)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端的1 5個(gè)氨基酸缺失的 氨基酸序列中進(jìn)一步置換1 數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。上述的b) g)的氨基酸序列，規(guī)定為構(gòu)成具有如下性質(zhì)的多肽保持了存在于 SU18中的表位，具有使Sur/Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性；或具有由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì) 存活蛋白或SU18特異性的Th細(xì)胞的表位。b) g)中規(guī)定的置換、缺失或添加的氨基酸殘基的種類只要在保持之前所示的 多肽的活性或功能的范圍內(nèi)則沒(méi)有特別限制，b)和f)中的添加1 數(shù)十個(gè)氨基酸是指添 加1 50個(gè)氨基酸、優(yōu)選添加1 30個(gè)氨基酸、進(jìn)一步優(yōu)選添加1 15個(gè)氨基酸。上述的氨基酸的置換、缺失或添加的優(yōu)選例為沉默置換(silent)、缺失、和添加， 尤其優(yōu)選保守性氨基酸間的置換。這些例子，對(duì)于本發(fā)明的多肽使Sur/Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因 子的活性、或由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)存活蛋白或SU18特異性的Th細(xì)胞的表位沒(méi)有改變。 代表性的保守性置換可舉出疏水性氨基酸Ala、Val、LeU、和Ile之間的相互置換、羥基氨基 酸Ser和Thr的相互置換、酸性殘基Asp和Glu的相互置換、酰胺型氨基酸Asn和Gln的相 互置換、堿性氨基酸Lys和Arg的相互置換、芳香類氨基酸Phe和Tyr的相互置換等。SU18具有如下的活性通過(guò)孵育存活蛋白、抗原提呈細(xì)胞和⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞，使由 ⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)的Sur/Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。這意味著，SU18具有被Sur/Th細(xì)胞識(shí) 別的表位，進(jìn)一步，該表位被獲取存活蛋白的抗原提呈細(xì)胞的表面所表達(dá)的MHC II類分子 提呈。因此，含有存活蛋白、SU18和Sur/Th細(xì)胞的惡性腫瘤治療劑為本發(fā)明的一個(gè)方式。此外，含有通過(guò)孵育存活蛋白和/或SU18、抗原提呈細(xì)胞和⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞而由⑶4陽(yáng)性T 細(xì)胞誘導(dǎo)的對(duì)SU18特異性的Th細(xì)胞的惡性腫瘤治療劑也是本發(fā)明的一個(gè)方式。認(rèn)為SU18對(duì)于具有HLA-DRB1*0101這一 HLA基因型的人為腫瘤抗原，同時(shí)，對(duì)HLA 的基因型為HLA-DRB1*1201/HLA-DRG1*1502、或HLA-DQB1*0601的人而言也是成為腫瘤抗 原的多肽。上述的各多肽均是能夠用作惡性腫瘤治療劑的一個(gè)成分的新的多肽，具有由CD4 陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)該多肽特異性的Th細(xì)胞的活性和/或使所述Th細(xì)胞或Sur/Th細(xì)胞產(chǎn)生 細(xì)胞因子的活性。上述的各多肽的、使對(duì)該多肽或存活蛋白特異性的Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子 的活性，可通過(guò)利用各種公知的方法測(cè)定用該多肽刺激該Th細(xì)胞時(shí)所產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn) 行確認(rèn)。例如，干擾素Y(IFN-Y)的產(chǎn)生可使用BD Bioscience制以及其它市售的ELISA 試劑盒簡(jiǎn)便地測(cè)定、確認(rèn)。此外，本發(fā)明的一個(gè)方式即前述的各多肽只要具有構(gòu)成其的氨基酸序列即可， 例如還能夠進(jìn)一步加上對(duì)蛋白的分離純化有用的通用標(biāo)簽序列His-Tag、適當(dāng)?shù)倪B接子 (linker)序列、GFP類標(biāo)記蛋白的氨基酸序列等，或者在多肽上添加生物素等標(biāo)記化合物。 因此，對(duì)構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方式即多肽的氨基酸序列，出于除了使對(duì)這些多肽特異性的Th 細(xì)胞、Sur/Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子或由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)前述細(xì)胞之外的目的，而添加了 任意的氨基酸殘基、從而形成的氨基酸序列所構(gòu)成的多肽、還是對(duì)本發(fā)明的多肽添加適當(dāng) 的標(biāo)記化合物的多肽，只要具有使該細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性或具有由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘 導(dǎo)特異性的Th細(xì)胞的表位，則這種多肽依然包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的多肽，可通過(guò)對(duì)編碼其的DNA應(yīng)用各種公知的基因重組手法以重組蛋白 形式制造該多肽。典型的例子為，使用適當(dāng)?shù)腄NA合成儀合成編碼本發(fā)明的多肽的DNA，適 當(dāng)選擇或組合該技術(shù)領(lǐng)域的參考書例如Sambrook等的Molecular Cloning :A Laboratory Manual、第 2 版(Cold Spring Harbor La boratory Press、1989 年等)中介紹的各種方 法，構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明的多肽的表達(dá)載體，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，生 產(chǎn)該多肽。如前所述，此時(shí)可增加用于制造重組多肽的各種操作，如添加組氨酸標(biāo)簽等。此外，本發(fā)明的多肽還可以以經(jīng)各種保護(hù)基修飾過(guò)的氨基酸為原料通過(guò)化學(xué)合成 來(lái)制造。不使用基因、宿主細(xì)胞而通過(guò)有機(jī)化學(xué)方法合成多肽的方法，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而 言是眾所周知的。例如，“第5版實(shí)驗(yàn)化學(xué)講座16有機(jī)化合物的合成IV” (相本三郎等著、 日本化學(xué)會(huì)編)等介紹了多肽的化學(xué)合成的各種方法，本發(fā)明的多肽可使用這些方法中的 任意一種來(lái)合成。此外，也可使用通常被稱為多肽合成儀的市售儀器來(lái)合成。上述的多肽通過(guò)在適當(dāng)條件下與抗原提呈細(xì)胞和⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞進(jìn)行孵育，能夠 將⑶4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)為Th細(xì)胞。這樣，本發(fā)明也提供一種在體外對(duì)表達(dá)HLA II類分子 的抗原提呈細(xì)胞、CD4陽(yáng)性T細(xì)胞和上述的多肽進(jìn)行孵育，來(lái)誘導(dǎo)對(duì)上述的多肽和/或存活 蛋白特異性的Th細(xì)胞的方法。在孵育中，除IL-2外，優(yōu)選添加IFN- y、IL-12、或抗IL-4抗 體中的一種以上，在所述條件下，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-Y且較少產(chǎn)生IL-4的Thl細(xì)胞。如前所述，該方法中能夠利用的抗原提呈細(xì)胞只要是在表面表達(dá)HLA II類分子的 細(xì)胞即可，除樹突狀細(xì)胞外，可列舉出B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、非增殖性的轉(zhuǎn)染子等， 但并不限定于此。另外，孵育既可以是同時(shí)對(duì)上述多肽、抗原提呈細(xì)胞和CD4陽(yáng)性T細(xì)胞進(jìn) 行孵育；也可以是先孵育本發(fā)明的多肽和抗原提呈細(xì)胞，然后在CD4陽(yáng)性T細(xì)胞共存下進(jìn)行孵育。此外，孵育本發(fā)明的肽、在細(xì)胞表面表達(dá)HLA II類分子的抗原提呈細(xì)胞和CD4陽(yáng)性 T細(xì)胞的各種條件方面，如前所述，可以是按照常規(guī)方法例如前述Tim等所述的方法中的孵 育條件來(lái)確定，即，通過(guò)HLA II類分子的介導(dǎo)使抗原提呈細(xì)胞提呈所需的抗原，由CD4陽(yáng)性 T細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)該抗原特異性的成熟Th細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，由患者處回收抗原提呈細(xì)胞和CD4陽(yáng)性T細(xì)胞，將其與本發(fā)明 的多肽一起孵育，從而能在體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)Sur/Th細(xì)胞。將根據(jù)該方法誘導(dǎo)的Sur/Th細(xì) 胞回輸給患者，從而激活患者自身的免疫系統(tǒng)，能夠期待腫瘤細(xì)胞的萎縮。此外，本發(fā)明的多肽，通過(guò)將其投與給兔子等適當(dāng)?shù)膭?dòng)物，能在該動(dòng)物體中誘導(dǎo)特 異性識(shí)別存活蛋白的抗體。這樣的抗體能夠特異性檢測(cè)表達(dá)存活蛋白的細(xì)胞的存在、即癌 細(xì)胞的存在，能夠有效用于惡性腫瘤的診斷。本發(fā)明的惡性腫瘤治療劑中，除腫瘤抗原和對(duì)該腫瘤特異性抗原特異性的Th細(xì) 胞外，在不妨害上述作用的范圍內(nèi)，還可以含有藥物制劑化中通常使用的各種賦形劑、其它 藥物活性成分等。尤其是，本發(fā)明的惡性腫瘤治療劑優(yōu)選處于能夠穩(wěn)定保持腫瘤抗原和對(duì) 該腫瘤特異性抗原特異性的Th細(xì)胞的緩沖液或液體培養(yǎng)基的形態(tài)。緩沖液的非限定性例子，可舉出中性的緩沖生理鹽水或磷酸緩沖生理鹽水等。此 外，還可進(jìn)一步含有例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、麥芽糖等糖質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、抗 氧化劑、抑菌劑、螯合劑(例如、EDTA或谷胱甘肽)、佐劑(例如、氫氧化鋁)、滲透壓調(diào)節(jié)劑、 懸浮劑、增粘劑和/或防腐劑等。此外，本發(fā)明的惡性腫瘤治療劑優(yōu)選處于腫瘤抗原和對(duì)該腫瘤特異性抗原特異性 的Th細(xì)胞混合的形態(tài)，也可以處于腫瘤抗原和該對(duì)腫瘤特異性抗原特異性的Th細(xì)胞分別 保存而在使用時(shí)混合并投與的所謂試劑盒形態(tài)。以下，示出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的 限制。
實(shí)施例<實(shí)施例1>SU18的鑒定1)肽的合成如由存活蛋白_2B(序列號(hào)56)的第1 20位的氨基酸序列構(gòu)成的肽、第8 27 位的氨基酸序列構(gòu)成的肽、第14 34位的氨基酸序列構(gòu)成的肽這樣，從存活蛋白的N末端 至C末端共設(shè)計(jì)25種(記作SUl SU27)在C末端和/或N末端具有7 8氨基酸的重 疊序列(Overlap sequence)的19 20個(gè)氨基酸殘基所構(gòu)成的肽(表1)，分別進(jìn)行化學(xué)合 成。表 1
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權(quán)利要求
一種多肽，其由下述的a)～g)中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，且具有使對(duì)存活蛋白特異性的Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性，a)序列號(hào)17所示的氨基酸序列；b)在序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加1～數(shù)十個(gè)任意的氨基酸而成的氨基酸序列；c)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端的1～4個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；d)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的C末端的1～5個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列；e)序列號(hào)17所示的氨基酸序列中的1～數(shù)個(gè)氨基酸殘基被置換和/或缺失的氨基酸序列；f)在序列號(hào)17所示的氨基酸序列中的1～數(shù)個(gè)氨基酸殘基被置換和/或缺失的氨基酸序列的N末端和/或C末端，添加1～數(shù)十個(gè)任意的氨基酸而成的氨基酸序列；g)序列號(hào)17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端的1～5個(gè)氨基酸缺失的氨基酸序列中進(jìn)一步置換了1～數(shù)個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中，b) g)的氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有由序列號(hào) 17所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽所具有的表位，該表位由CD4陽(yáng)性T細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)存活蛋白 特異性的Th細(xì)胞。
3.—種核酸，其編碼權(quán)利要求1或2所述的多肽。
4.一種載體，其含有權(quán)利要求3所述的核酸。
5.一種抗體，其與權(quán)利要求1或2所述的多肽特異性結(jié)合。
6.一種惡性腫瘤免疫治療用疫苗，其以權(quán)利要求1或2所述的多肽中的至少一種以上 作為有效成分。
7.一種誘導(dǎo)對(duì)存活蛋白特異性的Th細(xì)胞的方法，所述方法包括在體外對(duì)權(quán)利要求1或 2所述的多肽中的至少一種以上、抗原提呈細(xì)胞和CD4陽(yáng)性T細(xì)胞進(jìn)行孵育的工序。
8.—種惡性腫瘤治療劑，其含有權(quán)利要求1或2所述的多肽、以及對(duì)該多肽或存活蛋白 特異性的Th細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供新的腫瘤抗原、和在利用該腫瘤抗原治療惡性腫瘤的方法中有用的新的治療劑以及能夠用于該治療劑的腫瘤抗原。本發(fā)明提供新的腫瘤抗原和其利用法，所述腫瘤抗原具有誘導(dǎo)作為對(duì)存活蛋白特異性的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的Th1細(xì)胞的表位。本發(fā)明為一種多肽，其由序列號(hào)17所示的氨基酸序列等構(gòu)成，且具有使對(duì)存活蛋白特異性的Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的活性。本發(fā)明的肽具有下述活性將其與抗原提呈細(xì)胞和CD4陽(yáng)性T細(xì)胞一起孵育，從而誘導(dǎo)對(duì)存活蛋白特異性的Th細(xì)胞，此外，使該Sur/Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。
文檔編號(hào)A61P37/04GK101981187SQ20098011174
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日
發(fā)明者西村孝司 申請(qǐng)人:株式會(huì)社生物免疫平衡