(CH2_Ph) -Thr-Trp-Ser-Ser-Ser (p)
[0157] 可選擇地，在化合物14中，C末端甘氨酸包含極性基團(tuán)：
[0158] 化合物 14 :Ac_Tyr-Trp-Gly
[0160] 組成氨基酸可具有確定的立體化學(xué)，通常是天然"L"對映體，并且可具有天然存在 的或合成的側(cè)鏈。肽"N"末端可以是游離的、烷基化的、磺化的或酰化的。"C"末端可以是 羧酸或酰胺。
[0161] 可涉及各種天然和非天然氨基酸。色氨酸吲哚側(cè)鏈可被烷基、烷氧基、鹵素、羧基 等取代以形成其它的類似物。苯丙氨酸、酪氨酸和高苯丙氨酸苯基部分可具有另外的苯基 取代，例如烷基、烷氧基、鹵素、羧基等。絲氨酸可在一些實(shí)例中被丙氨酸取代。蘇氨酸可由 絲氨酸或丙氨酸取代。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸可在一些類似物中互換。具有羧酸側(cè)鏈 的氨基酸例如天冬氨酸，可具有衍生為酰胺的側(cè)鏈。
[0162] III.臨床治療
[0163] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及施用PCSK9變構(gòu)抑制劑肽至具有心血管疾病的癥 狀的受試者。在一個實(shí)施方案中，所述心血管疾病包括高膽固醇血癥。在一個實(shí)施方案中， 所述心血管疾病包括高血壓。在一個實(shí)施方案中，高膽固醇血癥包括升高的低密度脂蛋白 水平。
[0164] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及施用PCSK9變構(gòu)抑制劑肽至具有代謝性疾病的癥 狀的受試者。在一個實(shí)施方案中，所述代謝性疾病包括糖尿病。
[0165] 雖然沒有必要了解發(fā)明的機(jī)制，但據(jù)信PCSK9變構(gòu)抑制劑合成肽（8卩，例如51?55) 的施用誘導(dǎo)PCSK9蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，使得低密度脂蛋白結(jié)合位點(diǎn)對于低密度脂蛋白受體的 親和力降低，其中PCSK9/LDL-R復(fù)合物形成減少。PCSK9/LDL-R復(fù)合物形成的減少導(dǎo)致用 于結(jié)合循環(huán)LDL的LDL-R受體的生物利用度增加，從而增加 LDL通過LDL-R的內(nèi)化和清除。 還相信，PCSK9變構(gòu)抑制劑肽導(dǎo)致肝細(xì)胞LDL-R的生物利用度增加。
[0166] A.高膽固醇血癥
[0167] 高膽固醇血癥（也稱為血膽脂醇過多）是高水平膽固醇在血液中的存在。它 是"高脂血癥"（血液中的脂質(zhì)水平升高）和"高脂蛋白血癥"（血液中的脂蛋白水平升 高）的一種形式。Durrington, P"Dyslipidaemia"The Lancet 362 (9385) : 717-731。高 膽固醇血癥通常是由于遺傳和環(huán)境因素的組合引起的。環(huán)境因素包括肥胖和飲食選 擇。遺傳貢獻(xiàn)通常是由于多基因的累加效應(yīng)引起的，雖然偶爾可以是由于單一基因缺 陷（例如在家族性高膽固醇血癥的情況下）引起的。存在一些次要原因，包括：2型糖尿 病，肥胖，酒精，單克隆丙種球蛋白病，透析，腎病綜合征，梗阻性黃疸，甲狀腺功能減退， 庫欣氏綜合征，神經(jīng)性厭食癥，藥物（噻嗪類利尿劑，環(huán)孢素，糖皮質(zhì)激素，β-阻滯劑， 視黃酉愛）。Bhatnagar 等人，（2008)''Hypercholesterolaemia and its management〃BMJ 337:a993。在一些情況下遺傳異常完全負(fù)責(zé)高膽固醇血癥，例如在家族性高膽固醇血癥 中，其中在常染色體顯性APOB基因、常染色體隱性LDLRAP1基因、PCSK9基因的常染色 體顯性家族性高膽固醇血癥（HCH0LA3)變體或LDL受體基因中存在一個或多個基因突 變?！℉ypercholesterolemia〃Genetics Home Reference U. S. National Institutes of Health, ghr. nlm. nih. gov/condition = hypercholesterolemia。即使不存在負(fù)責(zé)高膽固 醇血癥的單一突變，但遺傳素質(zhì)仍然與久坐的生活方式、肥胖或動脈粥樣化飲食組合地起 著主要作用。Citkowitz 等人，（2010)〃Polygenic Hypercholesterolemia〃.eMedicine Medscape, emedicine. medscape. com/article/121424-〇verview〇
[0168] 膽固醇是一種固醇。其是所有動物細(xì)胞利用來構(gòu)造它們的膜的脂質(zhì)的三個主要 類別之一，并因此由所有的動物細(xì)胞制造。植物細(xì)胞不制造膽固醇。其還是類固醇激素、 膽汁酸和維生素 D的前體。由于膽固醇不溶于水，故其在血漿中于蛋白顆粒（脂蛋白）內(nèi) 進(jìn)行運(yùn)輸。脂蛋白通過其密度進(jìn)行分類：極低密度脂蛋白（VLDL)、中密度脂蛋白（IDL)Jg 密度脂蛋白（LDL)和高密度脂蛋白（HDL)。Biggerstaff 等人，（2004). "Understanding lipoproteins as transporters of cholesterol and other Iipids^Adv Physiol Educ 28(1-4) :105-6。所有脂蛋白攜帶膽固醇，但HDL以外的脂蛋白（稱為非-HDL膽固醇），特別 是LDL-膽固醇的水平升高與動脈粥樣硬化和冠狀動脈心臟疾病的風(fēng)險增加有關(guān)。Carmena 等人，（2004)''Atherogenic lipoprotein particles in atheroscIerosis^Circulation 109 (23Suppl I) : 1112-7。相反，較高水平的HDL膽固醇是保護(hù)性的。Kontush等 人，（2006)''Antiatherogenic small, dense HDL-guardian angel of the arterial wall? ^Nat Clin Pract Cardiovasc Med 3(3):144 一153。非-HDL 膽固醇和 LDL 在血 液中的水平升高可以是飲食、肥胖、繼承性（遺傳性）疾?。ɡ缂易逍愿吣懝檀佳Y中的 LDL受體突變）、或其它疾病例如糖尿病和甲狀腺功能低下的存在的結(jié)果。總膽固醇是在血 液中所有脂肪的量。這些脂肪被稱為脂質(zhì)。構(gòu)成總膽固醇的有不同類型的脂質(zhì)。最重要的 兩個類型是：低密度脂蛋白（LDL)- "壞"膽固醇和高密度脂蛋白（HDL)- "好"膽固醇。高 膽固醇，尤其是"壞"膽固醇（LDL)，會堵塞動脈。這可減少血液流向心臟。其可導(dǎo)致心臟 疾病、中風(fēng)或心臟病發(fā)作。膽固醇以毫克/分升（mg/dL)測量。在諸如心臟疾病或糖尿病 的病狀中，LDL膽固醇應(yīng)保持低于100mg/dL。如果存在心臟疾病的風(fēng)險，LDL膽固醇應(yīng)低于 130mg/dL。一般而言，LDL膽固醇應(yīng)低于160_190mg/dL。可選擇地，HDL "好"膽固醇應(yīng)是 高的。例如，男性中的HDL水平應(yīng)當(dāng)高于40mg/dL，而女性的HDL水平應(yīng)當(dāng)高于50mg/dL。
[0169] 高膽固醇血癥的一個癥狀包括血清膽固醇的長期升高，這可導(dǎo)致動脈粥樣硬化。 Bhatnagar 等人，（2008)''Hypercholesterolaemia and its management〃BMJ 337:a993〇 在數(shù)十年的時期內(nèi)，慢性升高的血清膽固醇促成動脈中動脈粥樣硬化斑的形成。這可導(dǎo)致 所涉及動脈的進(jìn)行性狹窄（變窄）或甚至完全阻塞（堵塞）。或者較小的斑可破裂并導(dǎo) 致凝塊形成，阻礙血液流動。Finn AV, Nakano M, Narula J, Kolodgie FD, Virmani R(July 2010) ·''Concept of vulnerable/unstable plaque^Arterioscler. Thromb. Vase. Biol 30(7) :1282-1292。冠狀動脈的突然阻塞導(dǎo)致心肌梗塞或心臟病發(fā)作。供應(yīng)腦的動脈的 阻塞可導(dǎo)致中風(fēng)。如果狹窄或阻塞的發(fā)展是漸進(jìn)的，對組織和器官的血液供應(yīng)慢慢減少， 直到器官功能變得受損。在此時，組織缺血（限制血液供應(yīng)）可表現(xiàn)為特定的癥狀，包括 但不限于，腦的短暫性缺血（通常被稱為短暫性腦缺血發(fā)作）可表現(xiàn)為暫時失明、眩暈和 平衡受損、失語（說話困難）、輕癱（乏力）和感覺異常（麻木或刺痛），通常表現(xiàn)在身體 的一側(cè)。對心臟的供血不足可表現(xiàn)為胸痛，以及眼的缺血可表現(xiàn)為一只眼的短暫性視力 喪失。對腿的供血不足可表現(xiàn)為行走時小腿疼痛，而在腸內(nèi)，其可呈現(xiàn)為吃飯后的腹痛。 Grundy 等人，（1998)''Primary prevention of coronary heart disease: guidance from Framingham:a statement for healthcare professionals from the AHA Task Force on Risk Reduction. American Heart Association^Circulation 97 (18):1876-1887。
[0170] B.低膽固醇血癥
[0171] 低膽固醇血癥（hypocholesterolemia)是在血液（-emia)中異常低（hypo-)水平 的膽固醇的存在。盡管高的總膽固醇（高膽固醇血癥）的存在與心血管疾病有關(guān)，但膽固 醇的體內(nèi)產(chǎn)生的缺陷也可導(dǎo)致不利的后果。膽固醇是哺乳動物細(xì)胞膜的主要成分，并且被 需要用來建立適當(dāng)?shù)哪B透性和流動性。目前尚不清楚低于平均的膽固醇水平是否是直接 有害的；但其常常在特定疾病中遇到。
[0172] 低膽固醇的可能原因包括但不限于，他汀類藥物、甲狀腺功能亢進(jìn)或甲狀腺過度 活躍、腎上腺功能不全、肝病、吸收不良（從腸道營養(yǎng)素吸收不足）例如在乳糜瀉中、營養(yǎng) 不良、無 β脂蛋白血癥（導(dǎo)致膽固醇讀數(shù)低于50mg/dl的遺傳性疾?。?、低β脂蛋白血癥 (導(dǎo)致膽固醇讀數(shù)低于50mg/dl的遺傳性疾病）、猛缺乏癥、Smith-Lemli-Opitz綜合征、馬 凡氏綜合征、白血病以及其它血液系統(tǒng)疾病。
[0173] 人口統(tǒng)計研究表明，低膽固醇與死亡率增加有關(guān)，主要是由于抑郁癥、癌癥、出血 性中風(fēng)、主動脈夾層和呼吸道疾病。Jacobs等人，（1992). "Report of the Conference on Low Blood Cholesterol!Mortality Associations^Circulation 86 (3):1046-1060 ； 和 Suarez E. C.，（1999)''Relations of trait depression and anxiety to low lipid and lipoprotein concentrations in healthy young adult women". Psychosom Med 61 (3) : 273-279。還可能的是，無論是什么原因?qū)е铝说湍懝檀妓剑湟矊?dǎo)致死亡，并且低 膽固醇只是健康狀況不佳的標(biāo)志。
[0174] C.糖尿病
[0175] 糖尿病影響超過2000萬美國人。超過4000萬美國人患有前驅(qū)糖尿病（其常常在 2型糖尿病之前發(fā)生）。糖尿病通常是終身（慢性）疾病，其中在血液中存在高水平的糖。 胰島素是由胰腺產(chǎn)生來控制血糖的激素。糖尿病可由胰島素太少、胰島素抗性或兩者導(dǎo)致。 為了理解糖尿病，重要的是首先理解其中食物被分解并由身體為能量而使用的正常過程。
[0176] 當(dāng)食物被消化時發(fā)生若干事件。一種稱為葡萄糖的糖進(jìn)入血流。葡萄糖是身體燃 料的來源。一種稱為胰腺的器官制造胰島素。胰島素的作用是將葡萄糖從血流移動進(jìn)入肌 肉、脂肪和肝細(xì)胞中，在那里它可被用作燃料。
[0177] 患有糖尿病的人具有高血糖，因?yàn)槠渖眢w不能將糖移動進(jìn)入脂肪、肝臟和肌肉細(xì) 胞中以被儲存用于能量。這是因?yàn)?，他們的胰腺不制造足夠的胰島素或者他們的細(xì)胞不正 常地響應(yīng)胰島素。
[0178] 糖尿病有兩種主要類型。對于每種類型的病因和風(fēng)險因素是不同的。1型糖尿病 可發(fā)生于任何年齡，但其最常見診斷于兒童、青少年或年輕成人中。在這種疾病中，身體制 造很少或不制造胰島素。需要每天注射胰島素。確切的病因不明。2型糖尿病構(gòu)成大多數(shù) 糖尿病病例。它最常發(fā)生于成年期。但由于高肥胖率，青少年和年輕成人現(xiàn)在被診斷患有 其。許多2型糖尿病患者不知道他們患有該病。
[0179] 妊娠期糖尿病是在沒有糖尿病的女性妊娠期間的任何時間發(fā)生的高血糖。
[0180] 糖尿病癥狀可以是由于高血糖水平引起的，并且包括但不限于，視力模糊、過度口 渴、疲乏、饑餓、常常排尿和體重減少。
[0181] IV.藥物組合物
[0182] 本發(fā)明還提供了藥物組合物（例如包含上文描述的肽）。取決于期望局部還是全 身治療以及取決于待治療的區(qū)域，本發(fā)明的藥物組合物可以以多種方式施用。施用可以是 局部的（包括眼和粘膜，包括陰道和直腸遞送）、肺部的（例如，通過吸入或吹入粉劑或氣霧 劑，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮）、口服的或腸胃外的。腸胃外施用包括靜 脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)（例如，鞘內(nèi)或心室內(nèi)）施用。
[0183] 用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴 劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)的藥物載體、水性、粉劑或油性基質(zhì)、增稠劑等可以是必 要的或期望的。
[0184] 用于口服、舌下或經(jīng)頰施用的組合物和制劑包括粉劑或顆粒劑、水或非水介質(zhì)中 的懸浮液或溶液、膠囊劑、凝膠、滴劑、條劑、樹膠、囊劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳 化劑、分散助劑或粘合劑可以是期望的。
[0185] 用于腸胃外、鞘內(nèi)或腦室內(nèi)施用的組合物和制劑可包括無菌水溶液，所述溶液還 可含有緩沖劑、稀釋劑和其它適合的添加劑，例如但不限于，滲透增強(qiáng)劑、載體化合物和其 它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0186] 本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于，溶液、乳劑和含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可 產(chǎn)生自各種組分，包括但不限于，預(yù)形成的液體、自乳化固體和自乳化半固體。
[0187] 在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還可包含其它藥物、激素和/或肽。例如，該 藥物組合物還可包含他汀類藥物。他汀類藥物（或HMG-CoA還原酶抑制劑）是一類用 于通過抑制酶HMG-CoA還原酶來降低膽固醇水平的藥物，其在膽固醇在肝臟中的產(chǎn)生 中起作用。升高的膽固醇水平與心血管疾病有關(guān)，因此他汀類藥物用于預(yù)防這些疾病。 Lewington 等人，''Blood cholesterol and vascular mortality by age, sex, and blood pressure:a meta-analysis of individual data from 61prospective studies with 55,000vascular deaths"Lancet 370(9602) :1829-1839 (2007)。研究已發(fā)現(xiàn)，他汀類 藥物作為二級預(yù)防策略用于治療心血管疾?。–VD)是最有效的，其在具有升高的膽固醇 水平但沒有先前的CVD的那些中的益處成疑Taylor等人〃Statins for the primary prevention of cardiovascular disease^. ImTaylorj Fiona. Cochrane Database Syst Rev(I) (2011)。他汀類藥物有罕見但嚴(yán)重的副作用，特別是肌肉損傷。
[0188] 他汀類藥物的具體實(shí)例包括但不限于阿托伐他汀（立普妥_?和 Torvast ?:〉，氟伐他汀（來適可? )，洛伐他?。澜抵?^ Altocor ?， Altoprev ? )，匹伐他?。↙ivalo ?，Pit脾a # ),普伐他?。ㄆ绽?， Selektine像，Lipostat ?),:瑞舒伐他?。–restor?)和辛伐他?。ㄊ?降之％ lipei 。他汀類藥物與另一種藥例如依折麥布/辛伐他汀劑的幾種組合制 劑也是可獲得的。
[0189] 心血管藥物的具體實(shí)例包括但不限于普萘洛爾，洋地黃，苯磺酸氨氯地平和硝苯 地平。
[0190] 其它藥物組合物的具體例實(shí)例還可包括但不限于依折麥布（Zetia?),苯 磺酸氨氯地平（絡(luò)活喜?,煙酸，西格列?。╦anuvia?),二甲雙胍或奧利司他 (Alii?/賽尼可?) *
[0191] 本發(fā)明的藥物制劑可方便地以單位劑量形式呈現(xiàn)，其可根據(jù)在制藥工業(yè)中熟知的 常規(guī)技術(shù)來制備。這樣的技術(shù)包括使活性成分與藥物載體或賦形劑聯(lián)合在一起的步驟。一 般而言，制劑通過使活性成分與液體載體或細(xì)碎的固體載體或兩者均勻地和緊密地聯(lián)合在 一起和隨后如果有必要的話使產(chǎn)品成形來制備。
[0192] 本發(fā)明的組合物可被配制為任何的多種可能劑型，例如但不限于片劑、膠囊、液體 糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可被配制為在水性、非水性或混合介質(zhì)中 的懸浮液。水性懸浮液可還包含增加懸浮液的粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨 醇和/或葡聚糖。懸浮液還可包含穩(wěn)定劑。
[0193] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，藥物組合物可被配制為和用作泡沫。藥物泡沫包括 制劑，例如但不限于乳劑、微乳劑、乳膏、凝膠劑和脂質(zhì)體。雖然在性質(zhì)上基本上類似，但這 些制劑在最終產(chǎn)品的成分和一致性上可不同。
[0194] 本發(fā)明的組合物可另外包含在藥物組合物中常規(guī)發(fā)現(xiàn)的其它輔助組分。因此，例 如，組合物可含有額外的、相容的、藥物活性的材料，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗 炎劑，或可含有另外的可用于物理配制本發(fā)明的組合物的各種劑型的材料，例如染料、調(diào)味 劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，這樣的材料，當(dāng)加入時，不應(yīng)不適當(dāng) 地干擾本發(fā)明的組合物的成分的生物活性。制劑可被滅菌并且如果需要的話，與輔助劑混 合，所述輔助劑為例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖 劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等，它們不與制劑中的活性藥物成分有害地相互作用。
[0195] 劑量的給予取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和響應(yīng)性，治療過程持續(xù)數(shù)天至數(shù) 月或直至實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減少。最佳劑量給予方案可由患者體內(nèi)藥物累積的測 量計算。施用醫(yī)師可容易地確定最佳劑量、劑量給予方法和重復(fù)率。最佳劑量可根據(jù)個體 寡核苷酸的相對效力而變化，并且通?？苫谠隗w外和體內(nèi)動物模型中發(fā)現(xiàn)有效的EC 5?；?基于本文描述的肽來估計。一般而言，劑量為〇. Ol μ g至l〇〇g/kg體重，并且可以每天、每 周、每月或每年給予一次或多次。治療醫(yī)師可基于體液或組織中藥物的經(jīng)測量的滯留時間 和濃度來估計劑量給予的重復(fù)率。成功治療后，可期望使受試者經(jīng)受維持療法以防止疾病 狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中肽以維持劑量施用，范圍為〇. Ol μ g至l〇〇g/kg體重，每日一次或多次至 每20年一次。
[0196] 實(shí)驗(yàn)
[0197] 實(shí)施例1
[0198] 細(xì)朐培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0199] 將缺失內(nèi)源 PCSK9 的 H印G2/shPCSK9 或 HuH7/shPCSK9 細(xì)胞（1)以 I X IO5細(xì)胞 / 孔接種在12孔微量培養(yǎng)板（Greiner Bio-One)中。隨后將這些細(xì)胞用0. 7 μ g/ml的V5標(biāo) 記的PCSK9或其功能獲得PCSK9D374Y溫育4小時或過夜，所述V5標(biāo)記的PCSK9或其功能 獲得PCSK9D374Y用各種肽在50 μ M (或更少，如果需要的話對大多數(shù)活性肽如此）下預(yù)溫 育4小時或不進(jìn)行預(yù)溫育。然后將細(xì)胞在含有1% Nonidet Ρ-40、0. 5%脫氧膽酸鈉、補(bǔ)充 有IX完全蛋白酶抑制劑混合物（Roche Applied Science)的0. 1% SDS的IX RIPA緩沖液 (150N頂?shù)腘aCl，50mM的三-鹽酸，pH8. 0)中裂解，并通過Western印跡分析。
[0200] 實(shí)施例1I
[0201] Western ￡口跡分析
[0202] 細(xì)胞裂解物中的蛋白通過10% Tris-甘氨酸SDS-PAGE解析。將凝膠印跡到聚偏 二氣乙?。≒VDF，Perkin Elmer Life Sciences)膜