TCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATC
TCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTCTCGGATCGGTACCGGGCCCCCCCTCG
AGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAG
AGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCC
AGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGG
GTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCC
GGGGGATCCACTAGTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATC
ATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAG
ATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAA
CCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGC
TGATGAATATCTTGTGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGCTTC
[0120](10) pPICZ aA-KS_12PFMAP 測(cè)序結(jié)果如下:
[0121]GACGGACTTTACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGATGAGA TTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTCTCGGATCGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGAGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG
[0122]從以上結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明中的方法，可以成功構(gòu)建出多倍體串聯(lián)基因pBluescript II KS_nPFWM(n為1、2、4、6或12)、成功構(gòu)建出畢赤酵母串聯(lián)表達(dá)載體pPICZa A-pBluescript II KS-nPFWMl (η 為 1、2、4、6 或 12)及畢赤酵母工程菌株 GS115_pPICZ a A-pBluescript II KS-nPFWMl(n 為 1、2、4、6 或 12)。
[0123]以上實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以上實(shí)施例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟: (1)選取合浦珠母貝肉抗氧化肽PFMAP，根據(jù)其氨基酸序列并按照畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)出其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，并進(jìn)一步構(gòu)建其核苷酸全長(zhǎng)序列，根據(jù)全長(zhǎng)序列，合成對(duì)應(yīng)的兩條單鏈，將兩條單鏈進(jìn)行PCR變性反應(yīng)，獲得合浦珠母貝肉抗氧化肽PFMAP目的基因，將PFMAP目的基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xho I和Sal I雙酶切，與同樣經(jīng)Xho I和Sal I雙酶切的pBluescript II KS質(zhì)粒相連接，得重組載體，然后將重組載體經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，制得單倍體重組載體pBluescript II KS-PFMAP ； (2)以單倍體重組載體pBluescriptII KS-PFMAP為模板，加入上下游通用引物M13\ M13-進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)為單倍體目的條帶基因pBluescript II KS-PFMAP，將目的條帶基因 pBluescript II KS-PFMAP 經(jīng)限制性內(nèi)切酶Quick Xba I和Quick Kpn I雙酶切后的基因，與同樣經(jīng)Quick Xba I和Quick KpnI雙酶切的PPICZ a A質(zhì)粒的基因相連接，制得合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體pPICZa A-pBluescript II KS-PFMAP ； (3)制備畢赤酵母菌GSl15感受態(tài)細(xì)胞，將GSl 15感受態(tài)細(xì)胞與用限制性內(nèi)切酶SacI單酶切線性化后的串聯(lián)表達(dá)載體pPICZ a A-pBluescript II KS-PFMAP進(jìn)行電轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)培養(yǎng)，即制備得畢赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-PFMAP。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟(I)中構(gòu)建其核苷酸全長(zhǎng)序列的過程是:選取合浦珠母貝肉抗氧化肽，在抗氧化肽的兩端加入內(nèi)切酶XhoI和Sail，并在兩端分別加上3?5個(gè)保護(hù)堿基，且在內(nèi)切酶和合浦珠母貝肉抗氧化肽基因之間加上溴化氰和羥胺所識(shí)別的蛋白切割位點(diǎn)，構(gòu)建合浦珠母貝肉抗氧化肽的核苷酸全長(zhǎng)序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟(I)中PCR變性反應(yīng)時(shí)的溫度為92?96°C，變性時(shí)間為2?5min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟(I)中將單倍體重組載體pBluescript II KS-PFMAP經(jīng)Xho I單酶切和去磷酸化處理后的基因，與PFMAP目的基因經(jīng)Xho I和Sal I雙酶切后的基因相連接，獲得2倍體重組載體pBluescript II KS-2PPFMAP，同理，可獲得4倍體重組載體pBluescript II KS-4PFMAP、6 倍體重組載體pBluescript II KS-6PFMAP 和 12 倍體重組載體pBluescript II KS-12PFMAP。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:去磷酸化采用去磷酸化酶SAP ;經(jīng)Xho I和Sal I雙酶切和去磷酸化處理后的PFMAP目的基因與經(jīng)Xho I單酶切和去磷酸化處理后的單倍體重組載體pBluescriptII KS-1PFffM的基因的摩爾比為3?10:1。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟(2)中還能以2倍體重組載體pBluescript II KS_2PFMAP、4倍體重組載體 pBluescript II KS_4 PFMAP、6 倍體重組載體 pBluescript II KS-6PFWM 或 12 倍體重組載體pBluescript II KS-12 PFMAP為模板，制得合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體 pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP、pPICZ a A-pBluescript II KS-4 PFMAP、pPICZa A-pBluescript II KS-6PFMAP 或 pPICZα Α-pBluescript II KS-12 PFMAP。7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟⑵中PCR反應(yīng)的參數(shù)為:94°C 2min，94°C 30s, 55 °C 30s，72°C 30s, 72°C 2min，4°C 5min ；35 個(gè)循環(huán)；步驟(2)中經(jīng) Quick Xba I 和 Quick Kpn I 雙酶切的pPICZ a A質(zhì)粒的基因與經(jīng)Quick Xba I和Quick Kpn I雙酶切的pBluescript IIKS-PFMAP的基因的摩爾比為3?10:1。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟(3)中還能將GS115感受態(tài)細(xì)胞與用限制性內(nèi)切酶SacI單酶切線性化后的串聯(lián)表達(dá)載體 pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP、pPICZ α Α-pBluescriptII KS-4PFMAP、 pPICZα Α-pBluescript II KS-6PFMAP 或 pPICZa A-pBluescriptII KS-12PFMAP進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、陽性平板篩選和誘導(dǎo)培養(yǎng)，制備得畢赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP、GSl 15-pPICZ a A-pBluescript IIKS-4PFMAP、GS115-pPICZ a Α-pBluescript II KS-6PFMAP 或GS115_pPICZ a A-pBluescriptII KS-12PFMAP。9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟(3)中電轉(zhuǎn)化時(shí)電壓為1200?1800V，電容為25 μ F，電阻為200 Ω。10.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是:步驟(3)中誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)采用BMMY培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用分子生物學(xué)和基因工程的方法構(gòu)建多倍體串聯(lián)基因pBluescriptⅡKS-nPFWM、構(gòu)建畢赤酵母串聯(lián)表達(dá)載體pPICZαA-pBluescriptⅡKS-nPFWM及畢赤酵母工程菌株GS115-pPICZαA-pBluescriptⅡKS-nPFWM1的方法，其中n為1、2、4、6或12；為其后期高效、穩(wěn)定表達(dá)抗氧化肽、工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)及其在化妝品、保健食品等領(lǐng)域應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1/19, C12N15/66, C12R1/84, C12N15/81
【公開號(hào)】CN105331626
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510599401
【發(fā)明人】吳燕燕, 馬永凱, 李來好, 楊賢慶, 趙永強(qiáng), 王錦旭, 林婉玲, 楊少玲, 鄧建朝, 馬海霞, 魏涯
【申請(qǐng)人】中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
【公開日】2016年2月17日
【申請(qǐng)日】2015年9月18日