一種合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]合浦珠母貝又稱馬氏珠母貝，屬軟體動(dòng)物門雙殼綱珍珠貝目珍珠貝科，是海水養(yǎng)殖珍珠貝主要品種，生產(chǎn)“南珠”的母貝。它主要分布在廣西、廣東和臺(tái)灣海峽南部沿海一帶，是我國(guó)養(yǎng)殖面積最廣、數(shù)量最大的人工養(yǎng)殖海水珍珠貝類之一。合浦珠母貝肉是一種高蛋白、低脂肪、低糖、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)質(zhì)蛋白來源的海產(chǎn)品，其粗蛋白干重含量在66.71%?81.2%之間，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所近幾年來一直致力于合浦珠母貝肉的開發(fā)利用，通過對(duì)珠母貝肉進(jìn)行定向酶解，得到小分子抗氧化活性肽，經(jīng)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析得到相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg ;與之對(duì)應(yīng)的氨基酸序列簡(jiǎn)寫為GAGLPGKRER(具體參閱申請(qǐng)?zhí)枮?01410040473.4的發(fā)明專利中所述)；該肽抗氧化活性強(qiáng)，且較穩(wěn)定，為了將這個(gè)抗氧化肽大量生產(chǎn)應(yīng)用，如果只是采用酶解珍珠貝肉的方法，由于酶解過程副反應(yīng)較多，含有多種其他肽類和小分子物質(zhì)，純化成本較高，產(chǎn)量又低。因此，急需尋找一種專一性強(qiáng)、成本低的方法來生產(chǎn)這種序列的合浦珠母貝肉抗氧化肽(PFMAP，Pinctada fucata meat ant1xidant peptides) ο
[0003]基因重組技術(shù)是當(dāng)前世界比較流行的方法，是大量制備多肽的研究熱點(diǎn)之一，現(xiàn)有技術(shù)中存在以下三種體外基因串聯(lián)的方法:一是隨機(jī)定向串聯(lián)法，該種方法串聯(lián)結(jié)果是不定向的，是隨機(jī)的，這在表達(dá)翻譯過程中可能導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的蛋白；二是化學(xué)拼接法，這個(gè)方法對(duì)于構(gòu)建多拷貝的(4倍以上)就不太適合，原因是人工合成序列成本高；三是PCR擴(kuò)增串聯(lián)法，這個(gè)與化學(xué)拼接法類似，也是隨著拷貝數(shù)增加，合成成本增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，該方法通過構(gòu)建合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株來獲取合浦珠母貝肉抗氧化肽，專一1性強(qiáng)，成本低。
[0005]本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0006](I)選取合浦珠母貝肉抗氧化肽PFMAP，根據(jù)其氨基酸序列并按照畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)出其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，并進(jìn)一步構(gòu)建其核苷酸全長(zhǎng)序列，根據(jù)全長(zhǎng)序列，合成對(duì)應(yīng)的兩條單鏈，將兩條單鏈進(jìn)行PCR變性反應(yīng)，獲得合浦珠母貝肉抗氧化肽PFMAP目的基因，將PFMAP目的基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xho I和Sal I雙酶切，與同樣經(jīng)Xho I和Sal I雙酶切的pBluescript II KS質(zhì)粒相連接，得重組載體，然后將重組載體經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，制得單倍體重組載體pBluescript II KS-PFMAP ；
[0007](2)以單倍體重組載體pBluescript II KS-PFMAP為模板，加入上下游通用引物M13+、M13-進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)為單倍體目的條帶基因pBluescript II KS-PFMAP,將目的條帶基因 pBluescript II KS-PFMAP 經(jīng)限制性內(nèi)切酶Quick Xba I和Quick Kpn I雙酶切后的基因，與同樣經(jīng)Quick Xba I和Quick Kpn I雙酶切的P PIC Z a A質(zhì)粒的基因相連接，制得合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體pPICZa A-pBluescript II KS-PFMAP ；
[0008](3)制備畢赤酵母菌GS115感受態(tài)細(xì)胞，將GS115感受態(tài)細(xì)胞與用限制性內(nèi)切酶SacI單酶切線性化后的串聯(lián)表達(dá)載體pPICZ a A-pBluescript II KS-PFMAP進(jìn)行電轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)培養(yǎng)，即制備得畢赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-PFMAP。
[0009]在上述合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法中:
[0010]步驟(I)中構(gòu)建其核苷酸全長(zhǎng)序列的過程是:選取合浦珠母貝肉抗氧化肽，在抗氧化肽的兩端加入內(nèi)切酶XhoI和Sail，并在兩端分別加上3?5個(gè)保護(hù)堿基，且在內(nèi)切酶和合浦珠母貝肉抗氧化肽基因之間加上溴化氰和羥胺所識(shí)別的蛋白切割位點(diǎn)，構(gòu)建得合浦珠母貝肉抗氧化肽的核苷酸全長(zhǎng)序列。
[0011]步驟(I)中PCR變性反應(yīng)時(shí)的溫度為92?96°C，變性時(shí)間為2?5min。
[0012]進(jìn)一步的:步驟(I)中將單倍體重組載體pBluescript II KS-PFMAPgXho I單酶切和去磷酸化處理后的基因，與PFMAP目的基因經(jīng)Xho I和Sal I雙酶切(Xho I和Sal I互為同尾酶)后的基因相連接，獲得2倍體重組載體pBluescript II KS-2PPFMAP，同理，可獲得 4倍體重組載體pBluescript II KS-4PFMAP、6 倍體重組載體pBluescript II KS-6PFMAP和 12 倍體重組載體 pBluescript II KS-12PFMAP。
[0013]其中去磷酸化采用去磷酸化酶SAP;經(jīng)Xho I和Sal I雙酶切和去磷酸化處理后的PFMAP目的基因與經(jīng)Xho I單酶切和去磷酸化處理后的單倍體重組載體pBluescript II KS-1PFMAP 的基因的摩爾比為 3 ?10:1。
[0014]進(jìn)一步的，步驟(2)中同樣能以2倍體重組載體pBluescript II KS_2PFWM、4倍體重組載體 pBluescript II KS_4PFMAP、6 倍體重組載體 pBluescript II KS-6PFMAP 或 12倍體重組載體pBluescript II KS-12PFMAP為模板，制得合浦珠母貝肉抗氧化肽的串聯(lián)表達(dá)載體 pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP、pPICZ α Α-pBluescript II KS-4PFMAP、pPICZa Α-pBluescript II KS-6PFMAP 或 pPICZ a Α-pBluescript II KS-12PFMAP。
[0015]步驟(2)中PCR 反應(yīng)的參數(shù)為:94 °C 2min，94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 30s，72 °C 2min，4°C 5min ;35個(gè)循環(huán)；步驟⑵中經(jīng)Quick Xba I和Quick Kpn I雙酶切的pPICZ a A質(zhì)粒的基因與經(jīng)Quick Xba I 和 Quick Kpn I 雙酶切的 pBluescript II KS-PFMAP的基因的摩爾比為3?10:1。
[0016]進(jìn)一步的，步驟⑶中同樣能將GS115感受態(tài)細(xì)胞與用限制性內(nèi)切酶SacI單酶切線性化后的串聯(lián)表達(dá)載體pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP、pPICZ α Α-pBluescript II KS-4PFMAP、pPICZαΑ-pBluescript II KS-6PFMAP 或pPICZ a Α-pBluescript II KS-12PFMAP進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性平板篩選和誘導(dǎo)培養(yǎng)，制備得畢赤酵母工程菌株 GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS_2PFMAP、GS115_pPICZ a Α-pBluescriptII KS-4PFMAP、GS115-pPICZa Α-pBluescript II KS-6PFMAP 或 GS115_pPICZ a A-pBluescript II KS-12PFMAP。
[0017]步驟(3)中電轉(zhuǎn)化時(shí)電壓優(yōu)選為1200?1800V、電容優(yōu)選為25 μ F、電阻優(yōu)選為200 Ω ;步驟⑶中誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)采用BMMY培養(yǎng)基。
[0018]本發(fā)明首次利用分子生物學(xué)和基因工程的方法構(gòu)建多倍體串聯(lián)基因pBluescript II KS_nPFMAP、構(gòu)建畢赤酵母串聯(lián)表達(dá)載體pPICZ a A-pBluescript II KS-nPFMAP 及畢赤酵母工程菌株 GS115_pPICZ α Α-pBluescriptII KS-nPFMAP，其中n為1、2、4、6或12 ;為其后期高效、穩(wěn)定表達(dá)抗氧化肽、工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)及其在化妝品、保健食品等領(lǐng)域應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0020](I)本發(fā)明就合浦珠母貝抗氧化肽活性小分子肽段而言，相對(duì)于傳統(tǒng)的酶解方法得到的純度高，這是因?yàn)楫叧嘟湍副磉_(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)后、純化后有標(biāo)簽蛋白更易純化；而傳統(tǒng)方法獲取的酶解液的酶解程度控制在不同批次會(huì)受到原料、操作人員、環(huán)境的影響而導(dǎo)致酶解程度的不一樣，從而使得合浦珠母貝肉酶解的小分子活性肽的大小不一，給后期的純化處理帶來不便；
[0021](2)本發(fā)明由于誘導(dǎo)培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，畢赤酵母菌生長(zhǎng)用培養(yǎng)基原料價(jià)格低廉，易于大規(guī)模生產(chǎn)獲得大量的抗氧化活性肽物質(zhì)；然而傳統(tǒng)的酶解方法由于受到原料成本、加工處理方式等條件的限制，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，相對(duì)于畢赤酵母發(fā)酵系統(tǒng)來講有著成本上、工藝上、單位時(shí)間產(chǎn)量上等諸多限制；
[0022](3)與【背景技術(shù)】中的3種常規(guī)方法相比，本發(fā)明方法采取的同尾酶法，可控制串聯(lián)體的大小和方向，適合10?20個(gè)氨基酸小分子活性肽的多拷貝構(gòu)建；
[0023](4)本發(fā)明采用體外基因串聯(lián)的方法，使得氨基酸序列增長(zhǎng)，而畢赤酵母工程菌株本身就是真核表達(dá)系統(tǒng)，具有亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以對(duì)長(zhǎng)鏈目的蛋白(20個(gè)氨基酸以上)進(jìn)行糖基化、磷酸化等進(jìn)一步修飾；體外基因串聯(lián)的方法剛好克服了小分子操作和表達(dá)效率不高這兩個(gè)問題，從而提高其應(yīng)用性；
[0024](5)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，可以快速構(gòu)建體外串聯(lián)小分子活性肽基因工程菌株，為后期小分子活性肽的在化妝品、保健食品領(lǐng)域中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0025]圖1是實(shí)施例2中制備的畢赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-2PFMAP ；
[0026]圖2是實(shí)施例3中制備的畢赤酵母工程菌株GS115_pPICZa A-pBluescript II KS-4PFMAP ；
[0027]圖3是實(shí)施例3中制備的畢赤酵母工程菌株GS115_pPICZa A-pBluescript II KS-6PFMAP ；
[0028]圖4是實(shí)施例3中制備的畢赤酵母工程菌株GS115-pPICZ a A-pBluescript II KS-12PFMAP0
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1
[0030]本發(fā)明涉及的合浦珠母貝肉抗氧化肽(PFMAP)的串聯(lián)表達(dá)載體和工程菌株的構(gòu)建方法如下:
[0031]1.修飾合浦珠母貝肉抗氧化肽(PFMAP)單倍體基因序列
[0032]按照畢赤酵母基因工程菌株的密碼子的偏好性，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件Primer Premier5.0 設(shè)計(jì)出與該 10 個(gè)氨基酸序列(Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg，參閱申請(qǐng)?zhí)?201410040473.4 的專利)對(duì)應(yīng)的基因序列:5’ -GGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGA-3’ ；其中AT含量為0.46，GC含量為0.54。在活性肽兩端加入的酶切位點(diǎn)分別為限制性內(nèi)切酶XhoI和SalI ;為了后期限制性內(nèi)切酶能順利的將酶切位點(diǎn)切開，選擇在兩端分別加上3?5個(gè)保護(hù)堿基(在XhoI酶切位點(diǎn)左邊加上CCG三個(gè)保護(hù)堿基；在SalI右邊加上GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 二十二個(gè)保護(hù)堿基)。為了后期構(gòu)建的串聯(lián)表達(dá)重組載體在誘導(dǎo)表達(dá)出多拷貝目的蛋白能重新切割成單倍體蛋白，因此設(shè)計(jì)在酶切位點(diǎn)和目的基因序列之間加上蛋白切割位點(diǎn)，分別是溴化氰(CNBr)[能識(shí)別甲硫氨酸(Met)]和羥胺(NH2OH)[能識(shí)別天冬酰胺(Asn)-甘氨酸(Gly)]。
[0033]設(shè)計(jì)完成后的基因全長(zhǎng)序列如下:
[0034]5，-CCGCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA-3，；
[0035]將上述分析完成的基因序列，合成對(duì)應(yīng)的兩條鏈如下:
[0036]PFMAP-Pl:
[0037]5 ’ -CCGCTCGAGATGGGTGCTGGTTTGCCAGGTAAGAGAGAGAGAAATGGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA-3，；
[0038