ylation-GoldKit對上步產(chǎn)物進行重 亞硫酸氫鹽處理，34μLEB洗脫。
[0101] (6)?〇?擴增：按下表體系進行反應，擴增條件為951€5分鐘；98 1€30秒，（98°(：10 秒，62°C30 秒，72°C30 秒）12cycles;72°C5 分鐘，4°C保存；
[0102]
[0103] 反應產(chǎn)物用1. 8倍Ampure磁珠純化，30μLEB洗脫。
[0104] (7)至此，傳統(tǒng)的RRBS建庫流程文庫構建完畢，共需要3天完成整個文庫構建，文 庫命名為RRCS140069-1-52。
[0105] 7. 12本發(fā)明的RRBS建庫流程
[0106] (l)MspI酶切：100ng起始建庫，按照下表反應體系進行酶切，37°C酶切6小時；
[0107]
[0108]酶切產(chǎn)物用QIA-quickPCRPurificationKit過膜純化，16. 0μLEB洗脫。
[0109] (2)末端修復和加"A" :按下表體系進行反應，條件為37°C反應1小時；
[0110]
[0111] 反應產(chǎn)物不純化，直接進行加"甲基化接頭"反應。
[0112] 備注：dNTP(無dTTP)中不含有dTTP，只有dCTP、dGTP和dATP三種，并且dCTP: dGTP:dATP的摩爾比為 1:1:10。
[0113] (3)加"甲基化接頭"：按下表體系進行反應，條件為20°C反應1小時；
[0114]
[0115]反應產(chǎn)物用QIA-quick PCR Purification Kit過膜純化，20μL ddH20洗脫。
[0116] (4)重亞硫酸氫鹽處理：采用EZ DNA Methylation-Gold Kit對上步產(chǎn)物進行重 亞硫酸氫鹽處理，17. 0 μ L EB洗脫。
[0117] (5)PCR擴增：按下表體系進行反應，擴增條件為98°C2分鐘；（98°C20秒，60°C30 秒，72°C1 分鐘）15cycles;72°C5 分鐘，4°C保存；
[0118]
[0119] 反應產(chǎn)物用1. 8倍Ampure磁珠純化，30μLEB洗脫。
[0120] (6)片段篩選：2%瓊脂糖凝膠電泳回收150~325bp文庫，QIA-quick Gel Extraction Kit進行膠純化回收，15μL EB洗脫。
[0121] (7)至此，本發(fā)明的RRBS建庫流程文庫構建完畢，共需要2天完成整個文庫構建， 文庫命名為RRCS140071-1-55。
[0122] 7. 2文庫質控
[0123] 將7. 1中構建完成的兩個RRBS文庫用安捷倫2100生物分析儀進行質檢，圖譜如 下。圖1為100ng起始量的傳統(tǒng)的RRBS建庫流程文庫RRCS140069-1-52檢測結果，圖2為 l〇〇ng起始量的本發(fā)明的RRBS建庫流程文庫RRCS140071-1-55檢測結果。
[0124] 由2100檢測圖可看出，圖2中150~300bp之間存在RRBS文庫2100峰圖最常見 的兩個尖峰，但是圖1中150~300bp之間只存在RRBS文庫2100峰圖最常見的一個尖峰。 說明針對起始量低的FFPE樣本來說，改進后的RRBS建庫流程構建的文庫片段分布與標準 的RRBS建庫流程文庫一致，文庫質控合格；但是如果采用傳統(tǒng)的RRBS建庫流程，針對FFPE 樣本構建出的文庫則丟失掉了一大部分的信息。從文庫質檢的結果上表明我們發(fā)明的RRBS 建庫的方法更適合于微量低質量的樣本。
[0125] 7. 3信息分析
[0126] 對傳統(tǒng)方法構建的RRBS文庫RRCS140069-1-52和本發(fā)明的RRBS文庫 RRCS140071-1-55進行SE50測序，對數(shù)據(jù)進行過濾比對后，所得到的數(shù)據(jù)質控結果如表1。
[0127] 表1兩種RRBS建庫流程文庫信息質控結果
[0128]
[0129] 由表1可看出，100ng起始量的DNA采用傳統(tǒng)方法做出的結果在Enzyme Cutting Rate(% )、Clean Q3〇Bases Rate(% )、Unique Mapped Rate (%)等參數(shù)都差于我們發(fā)明 的方法做出的結果。另外，同樣l〇〇ng起始量采用我們發(fā)明的方法構建文庫的5mC假陽性 率比傳統(tǒng)方法構建文庫降低約1/2,使得測序結果更符合CG位點中C的真實甲基化狀態(tài)。
[0130] 還需要說明的是，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中 作為某一技術方案的構成部分所描述的任一技術特征或技術特征的組合同樣也可以適用 于其它技術方案；并且，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術方案 的構成部分所描述的技術特征之間也可以以任意方式進行組合，來構成其它技術方案。本 發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術方案，并且這些技術方案相當于記載在本 說明書中。
[0131] 上述說明示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，如前所述，應當理解本發(fā)明并非局 限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和 環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改 動。而本領域技術人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明 所附權利要求的保護范圍內。
[0132] 工業(yè)實用件
[0133] 根據(jù)本發(fā)明，能夠適用于石蠟包埋樣本等低質量樣本的、簡化的表觀重亞硫酸氫 鹽測序用文庫的構建方法及建庫試劑盒。
【主權項】
1. 一種簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構建方法，該方法包括： 步驟A:用MspI限制性內切酶處理基因組DNA，得到酶切產(chǎn)物； 步驟B:將所述酶切產(chǎn)物進行末端修復及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其中， 所述末端修復中使用dCTP、dGTP與dATP的混合物提供單核苷酸，該混合物中dCTP:dGTP: dATP的摩爾比為1:1:5~1:1:20,且該混合物中不包含dTTP; 步驟C:將所述3'端加A的DNA片段加甲基化接頭，得到加甲基化接頭的DNA片段； 步驟D:將所述加甲基化接頭的DNA片段進行重亞硫酸氫鹽處理，得到重亞硫酸氫鹽處 理產(chǎn)物； 步驟E:所述重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物； 步驟F:將所述PCR擴增產(chǎn)物進行片段篩選。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述步驟A中的基因組DNA的量為50~500ng。3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述步驟A中的基因組DNA來自于低質量樣本。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，所述低質量樣本是石蠟包埋樣本。5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述步驟B中的所述混合物中，dCTP:dGTP:dATP 的摩爾比為1:1:9~1:1:11。6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述步驟B中采用包含所述酶切產(chǎn)物、缺失外切 酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反應緩沖液的反應體系，進行末端修復及3'端加 A； 反應條件為30~50°C、0. 5~12小時。7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述步驟C中采用包含所述3'端加A的DNA片 段、連接反應緩沖液、甲基化接頭以及T4DNA連接酶的反應體系，進行加甲基化接頭； 反應條件為10~30°C、0. 5~5小時。8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在所述步驟A與步驟B之間、步驟B與步驟C之 間、和/或步驟C與步驟D之間任選還包括產(chǎn)物純化步驟。9. 一種用于構建簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的試劑盒，其用于實施權利要求 1~8中任一項所述的方法，其包括： 用于對所述酶切產(chǎn)物進行末端修復的試劑，該試劑包括dCTP、dGTP與dATP的混合物， 該混合物中dCTP:dGTP:dATP的摩爾比為1:1:5~1:1:20,且該混合物中不包含dTTP。10. 根據(jù)權利要求9所述的試劑盒，其還包括選自下組中的至少一種或全部： 用于對所述基因組DNA進行MspI限制性內切酶處理的試劑； 用于所述3'端加A的試劑； 用于將所述3'端加A的DNA片段加甲基化接頭的試劑； 用于對所述加甲基化接頭的DNA片段進行重亞硫酸氫鹽處理的試劑； 用于對重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物進行PCR擴增的試劑；和 用于將所述PCR擴增產(chǎn)物進行片段篩選的試劑。
【專利摘要】根據(jù)本發(fā)明，能夠適用于石蠟包埋樣本等低質量樣本的、簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構建方法及建庫試劑盒。
【IPC分類】C40B50/06
【公開號】CN105274629
【申請?zhí)枴緾N201510792459
【發(fā)明人】洪燕, 徐護朝, 王曉雯, 趙紅梅, 玄兆伶, 李大為, 梁峻彬, 陳重建
【申請人】安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月17日