一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基含有5-10%的外源動物血清，應(yīng)用起來有如下不 足之處： 1) 應(yīng)用中存在批間差異，需要大量的驗(yàn)證工作； 2) 動物血清中含促進(jìn)生長的活性成分和抑制生長的成分，需測試才知對細(xì)胞生長的凈 作用； 3) 血清中蛋白含量高，成分復(fù)雜，據(jù)報(bào)道不下于150種，不利于下游的分離純化，阻礙 了細(xì)胞臨床應(yīng)用； 4) 外源動物血清常被病毒和支原體污染。
[0003] 綜合W上，動物血清培養(yǎng)基給生產(chǎn)及科研帶來許多不利因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提出了一種人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，具有群體倍增 時間短、細(xì)胞生長形態(tài)佳、細(xì)胞線粒體功能強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)： 一種人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包含無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基，生長因子， 細(xì)胞培養(yǎng)添加物，微量元素。
[0006] 進(jìn)一步，所述生長因子為堿性成纖維生長因子（bFGF)，白血病抑制因子（LIF)，其 中，含量為bFGF2-15ng/ml，優(yōu)選 5ng/ml，LIF5-15ng/ml，優(yōu)選化g/ml。
[0007] 進(jìn)一步，所述細(xì)胞培養(yǎng)添加物其包含：膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺，其中，含量為膜 島素5-20mg/L優(yōu)選lOmg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白2-15mg/L優(yōu)選5. 5g/L，乙醇胺0. 5-5mg/L優(yōu)選 2mg/L〇
[0008] 進(jìn)一步，所述微量元素為砸粉，含量為砸粉2-1化g/l，優(yōu)選6. 7gn/L。
[0009] 進(jìn)一步，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為L-DMEM(低糖培養(yǎng)基)。
[0010] 本發(fā)明提供一種改進(jìn)的人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基具有（a)群 體倍增時間短，（b)細(xì)胞生長形態(tài)佳，（C)細(xì)胞線粒體功能強(qiáng)等特點(diǎn)。并且他可1.避免批間 差異和不明的血清組分對細(xì)胞培養(yǎng)的影響；2.避免血清的外源性污染和對細(xì)胞毒性作用； 3.是產(chǎn)品易于純化，提高回收率，加速細(xì)胞治療臨床應(yīng)用的進(jìn)程；4.成分明確，有利于研究 細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)機(jī)制。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明中的培養(yǎng)基與市售無血清培養(yǎng)基在每代細(xì)胞的增殖次數(shù)對比。
[0012] 圖2為本發(fā)明中的培養(yǎng)基對人間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)后，在倒置顯微鏡下的拍照； 圖3為市售無血清培養(yǎng)基對人間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)后，在倒置顯微鏡下的拍照。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 為讓本領(lǐng)域的技術(shù)人員更加清晰直觀的了解本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明 作進(jìn)一步的說明。
[0014] 實(shí)施例1 根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，按照W下組分和配比配置培養(yǎng)基1。
[001引 kDMEM，堿性成纖維生長因子5ng/ml，白血病抑制因子7ng/ml，膜島素lOmg/L， 轉(zhuǎn)鐵蛋白5. 5mg/L乙醇胺2mg/L砸粉6. 7即/L。
[001引 實(shí)施例2 kDMEM，堿性成纖維生長因子2ng/ml，白血病抑制因子15ng/ml，膜島素5mg/L轉(zhuǎn)鐵 蛋白15mg/l，乙醇胺0. 5mg/l，砸粉2即/L。
[0017]實(shí)施例3 kDMEM，堿性成纖維生長因子15ng/ml，白血病抑制因子5ng/ml，膜島素20mg/l，轉(zhuǎn)鐵 蛋白2mg/L乙醇胺5mg/L砸粉10即/L。
[001引通過W下對比進(jìn)行本發(fā)明的結(jié)果檢測和對比。
[0019] 1.不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞群體倍增時間比較 取廝帶來源的人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞為培養(yǎng)對象，采用不同配方的培養(yǎng)基對其進(jìn)行培 養(yǎng)，其增殖能力均從第5代研究至第15代。每代廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長至約100%融合時， 0. 25%膜酶消化，制備成但細(xì)胞懸液，加入0. 4%臺吩藍(lán)染色2-3分鐘。計(jì)算每個培養(yǎng)皿中細(xì) 胞總數(shù)和死亡細(xì)胞數(shù)(死亡細(xì)胞被胎盤蘭染成藍(lán)色)，取平均值，連續(xù)10代，并計(jì)算每代的平 均細(xì)胞群體倍增數(shù)目PD，繪制累計(jì)細(xì)胞群體倍增曲線，如圖1所示。細(xì)胞群體倍增數(shù)目PD 由下述公式計(jì)算得出：PD= (lgNt-lgN0)/lg2,其中Nt:收集細(xì)胞數(shù)；NO:接種細(xì)胞數(shù)；t:培 養(yǎng)時間，本次采用的是實(shí)施例1的配比； 2. 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞后細(xì)胞生長形態(tài)比較； 采用不同配方的培養(yǎng)基對人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下拍照比較， 所得結(jié)果如圖2和圖3所示，其中圖2為實(shí)施例1的產(chǎn)品，圖3為市售無血清培養(yǎng)基； 3. 細(xì)胞線粒體功能比較； 利CellCountingKit(CCK-8)試劑盒比較經(jīng)不同配方培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細(xì)胞線粒體活 性，細(xì)胞增殖能力； 1) 在96孔板中接種細(xì)胞懸液（lOOul/孔)，向培養(yǎng)板中加入不同配方培養(yǎng)基，放在培養(yǎng) 箱中預(yù)培養(yǎng)（37°C，5%C02); 2) 向每孔加入lOulCCK-8溶液； 3) 將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)解育1-4小時； 4) 用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。
[0020] 人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后細(xì)胞的線粒體活力比較，所得結(jié)果如下 表所示：
結(jié)果表明，本發(fā)明中的培養(yǎng)基能夠提高廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增值能力，維持細(xì)胞的正 常形態(tài)。
[0021]W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：包含無血清動物細(xì)胞培養(yǎng) 基，生長因子，細(xì)胞培養(yǎng)添加物，微量兀素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述生長因 子為堿性成纖維生長因子，白血病抑制因子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述堿性成 纖維生長因子的含量為2-15ng/ml，所述白血病抑制因子的含量為5-15ng/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述堿性成 纖維生長因子的含量為5ng/ml，所述白血病抑制因子的含量為7ng/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述細(xì)胞培 養(yǎng)添加物其包含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述細(xì)胞培 養(yǎng)添加物的含量為胰島素5-20mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白2-15mg/L，乙醇胺0. 5-5mg/L。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述細(xì)胞培 養(yǎng)添加物的含量為胰島素l〇mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白5. 5mg/L，乙醇胺2mg/L。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述微量元 素為硒粉，含量為硒2-10ng/L。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述微量元 素及含量為硒粉6.7gn/L。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述無血 清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為L-DMEM。
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包含無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基，生長因子，細(xì)胞培養(yǎng)添加物，微量元素，具有群體倍增時間短、細(xì)胞生長形態(tài)佳、細(xì)胞線粒體功能強(qiáng)的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105200009
【申請?zhí)枴緾N201510666332
【發(fā)明人】曾令文, 列浦昌, 林姣
【申請人】中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月15日