工作臺（ARITECH日本）， 微量移液器值ragon芬蘭），酶標(biāo)儀度io-RAD德國），流式細(xì)胞儀度DAc州riC6美國）。
[0030] 二、試驗方法
[0031] 1、細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
[0032] 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1 %青霉素、1 %鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2天予更換新鮮培養(yǎng)基。待 細(xì)胞融合至80%左右后，吸除培養(yǎng)基，并用預(yù)熱的無菌憐酸酸鹽緩沖液洗3次，然后向培養(yǎng) 皿中加入含0. 25%族蛋白酶及0. 02%邸TA的細(xì)胞消化液ImL消化約2分鐘，光鏡下觀察 細(xì)胞，可見細(xì)胞逐漸回縮變圓，胞間間隙變寬，此時移除細(xì)胞消化液，加入完全培養(yǎng)基4mL 終止消化，ImL槍頭輕柔吹打制成細(xì)胞懸液，低速離屯、機(jī)lOOOrpm離屯、5分鐘，吸除上清液， 加入完全培養(yǎng)基重懸，輕柔吹打均勻后，根據(jù)經(jīng)驗按1:3~1:5傳代，傳代后的細(xì)胞置于培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培，約每周傳代2次，W保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期。細(xì)胞計數(shù)方法：細(xì)胞計數(shù)板 擦拭干凈，并將蓋玻片蓋在計數(shù)板上；將細(xì)胞懸液沿蓋玻片邊緣緩慢滴入計數(shù)板，光鏡下觀 察，細(xì)胞透明、折光性好為活細(xì)胞，計數(shù)4個大方格中的活細(xì)胞數(shù)。每細(xì)胞數(shù)=每個方格中 活細(xì)胞數(shù)平均值X稀釋倍數(shù)X104。
[0033] 2、CCK-8檢測細(xì)胞生存率
[0034] 取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，用含邸TA的0.25 %膜酶消化吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸 液并計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度約2X104個/mU將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每 孔100 置于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，吸除原培養(yǎng)基，按分組給予不同處理： 空白對照組（等量完全培養(yǎng)基），化合物（I)組設(shè)l、2、4mmol/l，每組設(shè)=個重復(fù)孔，無菌 PBS封閉周邊各孔，再次置于37°C、5% %培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24、48、72小時后取出96孔 板，吸除各組原有培養(yǎng)基，更換為100yLDMEM培養(yǎng)液，本底組無細(xì)胞只有DMEM培養(yǎng)液。每 孔加入lOyLCCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時。用全自動酶標(biāo)儀測定每孔吸光 度值（0D值），波長設(shè)定在450mn處，取每組復(fù)孔的均值。上述實驗步驟重復(fù)3次，計算平 均值。細(xì)胞生存率計算公式如下：細(xì)胞生存率=(實驗組0D值-本底組0D值）/(對照組 0D值-本底組0D值）X100%，繪制生長抑制曲線圖，并作統(tǒng)計學(xué)分析。
[0035] 3、Hoechst33258 染色
[0036] 實驗采用碧云天公司化echst33258染色液，細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時，會看到調(diào)亡細(xì)胞的 細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。根據(jù)細(xì)胞生存率結(jié)果，選取2mmol/L化合物（I ) 作用48小時作為化echst 33258染色的條件。將細(xì)胞消化、離屯、、計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度后種 入24孔板中，置于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，吸除原有培養(yǎng)基，按分組給予不同 處理：空白對照組（等量完全培養(yǎng)基），化合物（I)組設(shè)l、2、4mmol/l，無菌PBS封閉周 邊各孔，再次置于37°C、5% C〇2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后取出24孔板，吸除各組原有 培養(yǎng)基，無菌PBS洗3次，每孔加入0. 5mL多聚甲酸固定細(xì)胞15分鐘，PBS洗3次，各孔加 入100yL化echst 33258染色液，室溫黑暗環(huán)境下染色lOmin，去染色液，PBS搖床晃動沖 洗3次，每次5分鐘，洗盡液體，每孔滴加一滴抗巧光澤滅液，340nm波長的巧光顯微鏡下拍 照并觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。 陽037] 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞循亡
[0038] 根據(jù)細(xì)胞生存率結(jié)果，選取48小時作為檢測細(xì)胞稠亡的特定時間點。取處于對 數(shù)生長期且狀態(tài)良好的U251細(xì)胞，按常規(guī)消化傳代，接種于6孔板內(nèi)37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱 中解育12h，按分組給予不同處理：空白對照組（等量完全培養(yǎng)基），化合物（I)組設(shè)1、 2、4mmol/l，置于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，將原有培養(yǎng)液洗至5血離屯、 管中，PBS洗涂貼壁細(xì)胞2次，加入含有邸TA的適量膜酶消化細(xì)胞。室溫解育至輕輕吹打 可W使貼壁細(xì)胞吹打下來時，盡量吸盡膜酶細(xì)胞消化液。加入收集的原有細(xì)胞培養(yǎng)液，稍 混勻，轉(zhuǎn)移到5血離屯、管內(nèi)，lOOOg離屯、5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并 計數(shù)。取5萬個重懸的細(xì)胞，lOOOg離屯、5分鐘，棄上清，加入100yLAimexinV-門TC結(jié)合 液輕輕重懸細(xì)胞。加2mLAnnexinV-門TC，輕輕混勾。室溫避光輝育10分鐘。lOOOg離屯、 5分鐘，棄上清，加入2yL艦化丙唆染色液，輕輕混勾，冰浴避光放置15min。隨即進(jìn)行流 式細(xì)胞儀檢測，AmexinV-FITC為綠色巧光，PI為紅色巧光。記錄AnnexinV-門TC+PI+和 AnnexinV-門TC+PI-作為調(diào)亡細(xì)胞，每次計數(shù)10000個細(xì)胞，計算各組調(diào)亡率。
[0039] 4、統(tǒng)計學(xué)處理
[0040] 采用SPSS16. 0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實驗的結(jié)果，W均 數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。生存率的組間比較采用析因設(shè)計資料的方差分析，細(xì)胞調(diào)亡率的組間比 較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為a= 0. 05,P<0. 05為有顯著性差異，P<0. 01為極有顯 著性差異。
[0041]S、結(jié)果及結(jié)論
[0042] 1、化合物（I)對U251細(xì)胞生存率的影響
[0043] 化合物（I)抑制U251細(xì)胞存活生長CCK-8實驗結(jié)果顯示，不同濃度化合物（I) 作用U251細(xì)胞后，隨著作用濃度増高，作用時間加長，U251細(xì)胞生存率明顯下降，方差分 析顯示化合物（I)濃度因素的主效應(yīng)F= 945.8(P<0.01);作用時間因素的主效應(yīng)F= 302. 67 (P<0. 01)，濃度、時間因素的交互作用F= 45. 7 (P<0. 01)。結(jié)合表1，可發(fā)現(xiàn)化合物 (I)對U251細(xì)胞生存率的抑制作用呈時間、劑量依賴性，即化合物（I)濃度越高，作用 時間越長，其抑制作用越強(qiáng)。通過計算得出化合物（I)作用24h、48h、72h的ICs。值分別 為，3. 67mmol/L、1. 37mmol/L、1. 09mmol/L。
[0044] 2、化合物（I)對U251細(xì)胞稠亡形態(tài)學(xué)的影響
[0045] 正常組及化合物（I)處理組細(xì)胞經(jīng)化chest33258染色，巧光顯微鏡下觀察可見 對照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，且呈淡藍(lán)色均勻著色；而經(jīng)2mmol/L化合物（I)處理48小時后， 與對照組相比，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的固縮，顏色較為明亮，染色致密濃染，核碎裂明顯，且 可見典型的調(diào)亡小體。W上細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的改變提示化合物（I)有誘導(dǎo)U251細(xì)胞調(diào)亡 作用。
[0046] 3、化合物（I)對U251細(xì)胞調(diào)亡率的影響
[0047] 對照組及各處理組經(jīng)AnnexinV-門TC/PI染色后行流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示： 對照組、Immol/L化合物（I)、2mmol/L化合物（I)和4mol/L化合物（I)處理48小時 組細(xì)胞調(diào)亡率分別為3. 30 + 0. 98、14. 97 + 2. 67、27. 53 + 5. 51和55. 90 + 5. 1%。與對照組 相比，各處理組細(xì)胞的調(diào)亡率顯著增加（P<〇. 01)。結(jié)果見圖3。
[0048] 結(jié)論：化合物（I)通過抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡發(fā)揮對人腦惡性膠質(zhì)母細(xì) 胞瘤U251細(xì)胞的抑制作用。運些發(fā)現(xiàn)為化合物（I)治療膠質(zhì)瘤的臨床藥物研究提供依 據(jù)。 W例表1不同濃度化合物（I)處理作用24~72h后U251細(xì)胞生存率（均數(shù)+標(biāo) 準(zhǔn)差） 陽化0]
陽0川 實施例3
[0052] 片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。 陽〇5引 實施例4
[0054]口服液制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。 陽〇5引 實施例5
[0056] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0057] 實施例6
[0058] 注射液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0059] 實施例7
[0060] 無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌 烙封得粉針劑。
[0061] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含W下操作步驟：(a)將 白背葉的干燥葉粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石 油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇 萃取物；化）步驟（a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積， 再用80 %乙醇洗脫10個柱體積，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物浸膏； (C)步驟化）中80 %乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、12:1 和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一 步分離，依次用體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e) 步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水 溶液等度洗脫，收集10~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為AB-8 型大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為85 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物 (I)和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新二萜化合物。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的二萜類化合物，可以從白背葉的干燥葉中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物通過抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的抑制作用，這些發(fā)現(xiàn)為化合物(Ⅰ)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床藥物研究提供依據(jù)，可以用來開發(fā)成治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物。
【IPC分類】A61K31/365, A61P35/00, C07D307/92
【公開號】CN105198845
【申請?zhí)枴緾N201510648388
【發(fā)明人】吳正鋒
【申請人】吳正鋒
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月9日