一種用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新二萜化合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及從白背葉的干燥葉中分離得到的一種具有治 療神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用的二祗類(lèi)化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白背葉為大戟科化地orbiaceae野桐屬植物白背葉MallotusapeltaiXour.)Muell.Arg.[RicinusapeltaLour.]的根或葉，又名酒藥子樹(shù)、白膜葉等。味微苦、澀，性 平。我國(guó)主要分布于江蘇、安徽、江西、福建、河南、廣西、海南、陜西、云南等地。白背葉在民 間應(yīng)用廣泛，主要W根及葉入藥，根具有柔肝活血，健脾化濕，收斂固脫之功效，常用于慢性 肝炎，肝脾腫大，子宮脫垂，脫肛，白帶，妊娠水腫；葉能消炎止血，主要是外用，常用于中耳 炎，巧腫，跌打損傷，外傷出血。
[0003] 該屬植物含有豐富的化合物類(lèi)型，主要W苯并化喃類(lèi)、香豆素類(lèi)、=祗類(lèi)W及祗類(lèi) 化合物為主。苯并化喃衍生物主要存在于白背葉的葉子中；香豆素類(lèi)化合物主要存在于葉 子中，根和莖亦有分布；=祗類(lèi)化合物在白背葉的根、莖、葉中均有分布。祗類(lèi)化合物W二祗 類(lèi)為主，存在于葉子中。此外，白背葉還含有生物堿類(lèi)、黃酬類(lèi)W及揮發(fā)性成分。
[0004] 研究表明白背葉葉子部分有良好的止血、抗腫瘤作用，根部分具有較好的抗病毒 和保肝活性，特別是某些化學(xué)成分具有強(qiáng)烈的抑制HIV、逆轉(zhuǎn)錄酶或細(xì)胞DNA聚合酶的活 性，提示其具有應(yīng)用于治療乙肝和艾滋病的潛力。此外，有研究表明，白背葉根水煎劑對(duì)金 黃色葡萄球菌有抑制作用，乙醇提取物能夠抑制志賀頻疾桿菌；從根中分離出的化合物均 能在不同程度上抑制金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌及綠脈桿菌。白背葉煎劑和浸劑 能使釘螺的死亡率達(dá)到30 %~60 %。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明的目的是提供一種從白背葉的干燥葉中分離得到的一種具有治療神經(jīng)膠 質(zhì)瘤作用的二祗類(lèi)化合物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得W實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0008]
[0009] 所述的化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：(a)將白背葉的干燥葉粉 碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和 水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；化）步驟 (a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用80%乙醇洗 脫10個(gè)柱體積，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮得80%乙醇洗脫物浸膏；(C)步驟化）中 80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用 體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分 2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫， 收集10~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。
[0010] 進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。
[0011] 進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為85%。
[0012] 一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學(xué)上可接受的 載體。
[0013] 所述的化合物（I)在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可W直接使用，或者W藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、 對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 W及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物W單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說(shuō)明】 陽(yáng)〇1引圖1為化合物（I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較；
[0020] 圖3為化合物（I)處理后U251細(xì)胞桐調(diào)亡率的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。 陽(yáng)02引實(shí)施例1 :化合物（I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0023] 試劑來(lái)源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲燒為分析純，購(gòu)自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0024] 制備方法：(a)將白背葉的干燥葉（10kg)粉碎，用85%乙醇熱回流提取（2^X3 次），合并提取液，濃縮至無(wú)醇味（3L)，依次用石油酸（化X3次）、乙酸乙醋（化X3次）和水 飽和的正下醇0LX3次）萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物（431g)和正下醇 萃取物；化）步驟（a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔樹(shù)脂除雜，先用10 %乙醇洗脫8個(gè)柱 體積，再用80 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物 浸膏（157g) ;(c)步驟化）中80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1(8 個(gè)柱體積）、45:1 (8個(gè)柱體積）、25:1 (8個(gè)柱體積）、12:1 (8個(gè)柱體積）和1:1巧個(gè)柱體積） 的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（C)中組分4 (49g)用正相硅膠進(jìn)一步 分離，依次用體積比為20:1 (8個(gè)柱體積）、12:1 (10個(gè)柱體積）和5:1 (8個(gè)柱體積）的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2 (23g)用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10-12個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I) (34mg)。 陽(yáng)0巧]結(jié)構(gòu)確證：HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z395. 1508,結(jié)合核磁特征可得分子式 為C2化A，不飽和度為10。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)5H(Ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-1(2.98， d)，H-1 (2. 73,d)，H-3 (6. 85,s)，H-6 (2. 63,m)，H-6 (1. 25,t，J= 14. 4)，H-7 (1. 24,m)， H-8 (1. 55,m)，H-8 (1. 78,m)，H-9 (2. 52,dd，J= 8. 4, 2. 4)，H-10 (2. 06,dt，J= 12. 0, 2. 4)， 82,ddd，J= 10. 2,8. 4，1. 2)，H-12(4. 94,br，s)，H-14化.41，br，s)，H-15(7. 33， br，s)，H-16 (7.33,br，s)，H-17 (0.99,dd)，H-19 (1.20,s)，18-0Me(3.61，s);核磁共 振碳譜數(shù)據(jù) 5c(卵m，DMSO-de，150Hz) :38. 3 (邸2,1-C)，198. 9 (C，2-C)，130. 0 (CH，3-C)， 156. 9 (C，4-C)，36. 1 (C，5-C)，32. 9 (邸2, 6-C)，34. 8 (CH，7-C)，24. 2 (邸2, 8-C)，42. 0 (CH， 9-C)，37. 6 (CH，10-C)，39. 2 (CH，11-C)，78. 5 (CH，12-C)，123. 3 (C，13-C)，108. 2 (CH，14-C)， 143. 9 (CH，15-C)，138. 8 (CH，16-C)，12. 2 (邸3, 17-C)，167. 0 (C，18-C)，23. 1 (細(xì)3,19-C)， 177. 7(C，20-C)，51.3(CH3，18-0Me);碳原子標(biāo)記參見(jiàn)圖1。NMR譜表明，該化合物含有立個(gè) 甲基[5冊(cè).99((1(1，&-17)，1.20(3，&-19)和3.61(3，18-(116)]，^個(gè)亞甲基[5肥.98((1， H-1)，2. 73 (d，H-1)，2. 63 (m，H-6)，1. 25 (t，J= 14. 4Hz，H-6)，1. 55 (m，H-8)，1. 78 (m，H-8)]， 六個(gè)次甲基[5冊(cè).85(s，H-：3)，1.24(m，H-7)，2. 52(dd，J= 8. 4,2. 4Hz，H-9)，2. 06(化， J= 12. 0,2. 4Hz，H-10)，2. 82(ddd，J= 10. 2,8. 4，1.2Hz，H-ll)，4. 94 化r，s，H-12); 5C130. 0 (C-3)，34. 8 (C-7)，42. 0 (C-9)，37. 6 (C-10)，39. 2 (C-11)，78. 5 (C-12)]，一個(gè)e單 取代巧喃環(huán)[5C123. 3 (C-13)，108. 2 (C-14)，143. 9 (C-15)和 138. 8 (C-16)]，兩個(gè)內(nèi)醋幾基 [5C167. 0 (C-18)和 177. 7 (C-20) ]，W及一個(gè)a，P-不飽和幾基[5C198. 9 (C-2)]。根據(jù) HMBC譜中H-12與C-14和C-16的相關(guān)性，可推斷巧喃環(huán)位于C-12位上。N犯SY譜中&-19 與H-10，H3-19與H-7,化及H-7與H-12的相關(guān)性，表明它們均為a取向。綜合氨譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，W及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類(lèi)型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立 體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致（圖2)。
[0026] 實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn)
[0027] 一、材料和儀器
[002引本實(shí)驗(yàn)采用人腦惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中屯、。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；氯化鋼、氨氧化鋼、氯化鐘、氯化氧、氨氧化鋼、 憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘、甲醇購(gòu)自南京化工廠(chǎng)。化合物（I)自制，HPLC歸 一化純度大于98 %。甘氨酸、Tris、Tween20、二甲基亞諷（DMEM)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； Aimexin-V/PI細(xì)胞調(diào)亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、0.25%膜蛋白酶、 CellCountingKit-8 試劑盒、青霉素、鏈霉素、Hoechst33258、細(xì)胞核染料DAPI、PMSF、 Westernblot凝膠配制試劑盒、細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、5X 蛋白質(zhì)變性緩沖液盒、E化超敏發(fā)光液、顯影定影試劑盒、X線(xiàn)膠片、硝酸纖維素膜、抗巧光 澤滅封片液購(gòu)自江蘇碧云天生物研巧所。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物科技公司；兔抗人 P65抗體購(gòu)自美國(guó)N0VUS公司；兔抗人化stonH3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；山羊抗兔HRP二 抗購(gòu)自美國(guó)Santa化UZ公司；山羊抗兔巧光二抗購(gòu)自美國(guó)Earth化公司。
[0029]-20°C低溫冰箱（海爾青島），-80°C低溫冰箱（海爾青島），低溫冰箱（海爾青島）， 高速離屯、機(jī)（飛鶴上海），培養(yǎng)皿/板（Coming美國(guó)），離屯、管（Coming美國(guó)），細(xì)胞培養(yǎng)箱 燈hermo美國(guó)），倒置顯微鏡（Olympus日本），巧光倒置相差顯微鏡狂EISS德國(guó)），多用途 恒溫水浴箱（躍進(jìn)上海），電子天平儀（上海機(jī)密科學(xué)儀器），超凈