提高。在另一個實(shí)施方案中，所述癌癥是黑色素瘤、乳腺癌或GBM。BPTF的水平可W經(jīng) 由蛋白質(zhì)檢測、DNA檢測技術(shù)W及測量RNA表達(dá)來測定。
[0132] 在另一個實(shí)施方案中，本公開提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括施用有 效量的抑制BPTF的表達(dá)或活性的藥劑。
[0133] 如本文所用的術(shù)語"治療（treat)"、"治療（treating) "W及"治療（treatment)" 指的是使與疾病或病況例如黑色素瘤的相關(guān)的癥狀緩解，包括預(yù)防或延緩疾病癥狀發(fā)作和 /或減少所述疾病或病況的癥狀的嚴(yán)重程度或頻率。術(shù)語"受試者"和"個體"在本文被定 義為包括動物，如哺乳動物，包括但不限于靈長類動物、母牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚 鼠、大鼠、小鼠或其它?？苿游?、綿羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、曬齒類動物或 鼠類物種。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動物是人類。 陽134] 如本文所用的BPTF抑制劑的"有效量"是足W抑制患有癌癥的受試者的癌細(xì)胞的 增殖或侵襲性的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W容易地通過考慮W下因素來確定欲向給定受試者 施用的BPTF抑制劑的有效量：諸如受試者的體格大小和體重；疾病侵入的程度；受試者的 年齡、健康情況W及性別；施用途徑；W及施用是局部的還是全身性的。
[0135] 可W由包含含有抑制性BPTF劑的多核巧酸和/或減少BPTF表達(dá)的藥劑的組合物 治療的癌癥包括沒有血管化或尚未基本上血管化的腫瘤W及血管化的腫瘤。所述癌癥可W 包括非實(shí)體腫瘤（如白血病和淋己瘤）或可W是實(shí)體腫瘤。
[0136] 在一個具體的實(shí)施方案中，本公開提供了一種治療受試者的癌癥，如黑色素瘤、乳 腺癌或GBM的方法，所述方法包括施用有效量的抑制BPTF的表達(dá)或活性的藥劑。在另一 個實(shí)施方案中，所述藥劑是shRNA。在另一個實(shí)施方案中，所述藥劑是雙鏈miRNA模擬物。 miRNA模擬技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。參見例如Wang,Z. , 2009,miRNAmimictechnology(miRNA 模擬技術(shù)），Mic;roRNAInte;rferenceTechnologies!；《微小RNA干擾技術(shù)》），第 93-100 頁，Springer-LinkPublications。在另一個實(shí)施方案中，所述藥劑是基于寡核巧酸的BPTF 藥物。
[0137] 可W向受試者的細(xì)胞遞送編碼針對BPTF的shRNA或miRNA分子的表達(dá)載體W治 療或預(yù)防癌癥。所述核酸分子W其中它們可W被攝取的形式向受試者的細(xì)胞遞送并且被有 利地表達(dá)W使得可W實(shí)現(xiàn)治療有效水平。能夠表達(dá)BPTF shRNA的表達(dá)載體可商購自各種 供應(yīng)商。
[0138] 用于向細(xì)胞遞送包含減少BPTF表達(dá)的抑制性核酸劑的多核巧酸的方法包括使用 遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、聚合物、微球體、基因治療載體、修飾的核酸（例如電荷中和的核酸） 化及裸DNA載體。
[0139] 可W使用轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒（例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒W(wǎng)及腺相關(guān)病毒）載 體進(jìn)行體細(xì)胞基因療法，運(yùn)特別是因?yàn)樗鼈兊母吒腥拘蔠及穩(wěn)定的整合和表達(dá)（參 見例如Cayouette等，HumanGeneHierapy8:423-430(1997);Kido等jQirrentEye Research15:833-844(1996);Bloomer等，JournalofVirology71:6641-6649(1997); 化Idini等，Science272:263-267(1996) ;W及Miyoshi等，Proc.化tl.Acad.Sci. U.S.A. 94:10319 (1997))。舉例來說，可W將編碼針對BPTF的抑制性核酸的多核巧酸克 隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中并且它的表達(dá)可W由內(nèi)源性啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序 列、或?qū)δ康撵爰?xì)胞類型具有特異性的啟動子所驅(qū)動?？蒞使用的其它病毒載體包括例 如牛痘病毒、牛乳頭狀瘤病毒、或瘤疹病毒，如埃-己二氏病毒巧pstein-BarrVirus) (還參見例如W下參考文獻(xiàn)的載體：Miller,HumanGeneHierapy15-14, (1990); Rriedman,Science244:1275-1281(1989);Eglitis等，BioTechniques6:608-614(1988); Tolstoshev等,CurrentOpinioninBiotechnology1:55-61 (1990) ;Sh曰rp,The Lancet337:1277-1278(1991) ;Co;rnetta等，NucleicAcidResearchandMolecular Biology36 (31):1-322 (1987) ；Anderson,Science226:401-409(1984) ；Moen,Blood Cells17:407-416(1991);Miller等，Biotechnology7:980-990(1989);LeGalLa Salle等，Science259:988-990(1993);W及?Johnson,Chest107:77S-83S(1995))。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是特別健全的并且已經(jīng)被用于臨床環(huán)境中（Rosenberg等，N.Engl. J.Med323:370(1990);Anderson等，美國專利號 5, 399, 346;Gruber等，美國專利[0140] 在另一個實(shí)施方案中，本公開提供了治療性組合物，所述治療性組合物包含含有 抑制BPTF表達(dá)的針對BPTF的抑制性核酸的多核巧酸，從治療癌癥，如黑色素瘤。在另一個 實(shí)施方案中，本公開提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含抑制BPTF表達(dá)的藥劑。 陽141] 包含針對BPTF的抑制性核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表達(dá)的藥劑可W作為藥 物組合物的一部分被施用。所述藥物組合物優(yōu)選地是無菌的并且在適合于向受試者施用 的重量或體積單位中含有治療有效量的包含抑制性BPTF核酸的多核巧酸分子和/或抑制 BPTF表達(dá)的藥劑。 陽142] 包含抑制性BPTF核酸的治療性多核巧酸分子和/或抑制BPTF表達(dá)的藥劑可W與 藥學(xué)上可接受的載體一起在單位劑型中被施用。可W利用常規(guī)的藥學(xué)實(shí)踐來提供合適的制 劑或組合物W向患有癌癥的患者施用化合物。 陽143] 如本文所用的載體包括在所利用的劑量和濃度下對所暴露的細(xì)胞或哺乳動物無 毒的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。常常，生理學(xué)上可接受的載體是水性抑緩 沖溶液。生理學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括緩沖劑，如憐酸鹽、巧樣酸鹽W及其它有機(jī)酸； 抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量（少于約10個殘基）多膚；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明 膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙締化咯燒酬；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬 酷胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖、W及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；馨 合劑，如邸TA;糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成鹽平衡離子，如鋼；和/或非離子型表面活性 劑，如TWEEN?、聚乙二醇（PEG)W及PLURONICS?。
[0144] 包含抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表達(dá)的藥劑還可W被包封在例 如通過界面聚合制備的微膠囊中，例如分別在膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)（例如脂質(zhì)體、白蛋白微 球體、微乳液、納米粒子W及納米膠囊）中或粗乳液中的徑甲基纖維素或明膠微膠囊和聚 (甲基丙締酸甲醋）微膠囊。待用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。運(yùn)可容易地通過經(jīng)由 無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)?？蒞制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適實(shí)例包括固體疏水性 聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)包含含有抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表 達(dá)的藥劑，所述基質(zhì)呈成型制品（例如膜或微膠囊）的形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚 醋、水凝膠（例如聚（2-徑乙基-甲基丙締酸醋）或聚（乙締醇））、聚丙交醋（美國專利 號3, 773, 919)、k谷氨酸和丫-乙基-k谷氨酸醋的共聚物、不可降解的乙締-乙酸乙締 醋、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPR0NDEP0T?(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙 瑞林構(gòu)成的可注射微球體）；W及聚-D-(-)-3-徑下酸。雖然諸如乙締-乙酸乙締醋和乳 酸-乙醇酸等聚合物使得分子能夠釋放超過100天，但是某些水凝膠使分子釋放較短的時 間段。
[0145] 在另一個實(shí)施方案中，包含含有抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表 達(dá)的藥劑的藥物組合物聯(lián)同其它治療劑一起被施用。關(guān)于施用其它治療劑的"聯(lián)同"指的 是可W在包含含有抑制性BPTF核酸的多核巧酸和/或抑制BPTF表達(dá)的藥劑的藥物組合物 之前、同時或之后施用的藥劑。 陽146] 在另一個實(shí)施方案中，本公開提供了一種用于確定受試者患有癌癥和/或癌癥進(jìn) 展的可能性的試劑盒，所述試劑盒包含：a)與BPTF互補(bǔ)的寡核巧酸；W及b)任選的用于在 所述寡核巧酸與BPTF之間形成雜交的試劑。在另一個實(shí)施方案中，所述試劑盒任選地包括 用于監(jiān)測源自于受試者的生物樣品中標(biāo)志物的核酸分子水平的說明書。在另一個實(shí)施方案 中，所述試劑盒包含無菌容器，所述無菌容器容納引物、探針或其它檢測試劑；運(yùn)些容器可 W是盒、安飯、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝或本領(lǐng)域已知的其它合適的容器形式。運(yùn) 些容器可W由塑料、玻璃、層壓紙、金屬錐或適合于容納核酸的其它材料制成。說明書一般 將包括有關(guān)本文所述的引物或探針的使用W及它們在診斷癌癥中的用途的信息。優(yōu)選地， 所述試劑盒進(jìn)一步包含本文所述的診斷測定中所述的試劑中的任何一種或多種。在其它實(shí) 施方案中，所述說明書包括W下各項(xiàng)中的至少一種：引物或探針的說明；用于使用所附的 材料來診斷癌癥的方法；注意事項(xiàng)；警告；適應(yīng)癥；臨床或調(diào)查研究；和/或參考文獻(xiàn)。所述 說明書可W被直接印刷在容器（在存在時）上，或被印刷成施加到所述容器的標(biāo)簽、或在所 述容器中或連同所述容器一起供給的單獨(dú)的薄片、小冊子、卡片、或文件夾。 陽147] 在另一個實(shí)施方案中，本公開提供了 一種用于測定BPTF的表達(dá)水平的設(shè)備，所述 設(shè)備包括固體載體，其中所述固體載體的表面與和BPTF互補(bǔ)的寡核巧酸連接。在一個實(shí)施 方案中，所述設(shè)備是微陣列。固體載體的實(shí)例包括但不限于用于結(jié)合核酸的玻璃或硝化纖 維素載片。
[0148] W下實(shí)施例意圖說明，而不是限制本公開。雖然它們是可能使用的那些程序的典 型，但是可W替代性地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它程序。 陽149]實(shí)施例
[0150] 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：如所述度a曲eri等，2006;Dar等，2011)獲得C8161.9和 1205-Lu人類黑色素瘤W及B16-F10鼠類黑色素瘤細(xì)胞。U251和LN18成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤細(xì)胞系購自ATCC(弗吉尼亞州的馬納薩斯（Manassas，VA))。在含有5%胎牛血清 (FB巧的DMEM/F12 (加利福尼亞州卡爾斯己德的英杰生命科技公司（InvitrogenLife Technologies,Carlsbad,CA))中培養(yǎng)C8161. 9 細(xì)胞；在TU2 % 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1205-Lu 細(xì)胞；并且在含5 %FBS的RPMI-1640中培養(yǎng)B16-F10細(xì)胞。在含5 %FBS的DMEM 中培養(yǎng)U251和LN18。將所有細(xì)胞在37°C培養(yǎng)在含有5%C02的氣氛中。通過脂染 胺-2000(Lipofectamine-2000)(加利福尼亞州卡爾斯己德的英杰生命科技公司），根據(jù)制 造商的方案來進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。
[0151] 質(zhì)粒：質(zhì)粒PCMV6-BPTF、pcMV6-En付yW及BPTF祀向shRNA載體組（4個克 ?。﹑GFP-V-RS購自傲銳東源公司（化igene)(馬里蘭州羅克維爾的傲銳東源科技公司 (OrigeneTechnologiesRockvilleMD))。來自運(yùn)組的BPTFshRNAl和BPTFshRNA2 用于 鼠類細(xì)胞系。祀向BPTF的基于慢病毒的shRNA載體組巧個克?。≧HS4533_NM_0059,W引 用的方式并入本文）購自化enbiosystems公司（科羅拉多州的拉斐特化afayette,C0))。
[0152]RNA提取和cDNA合成：使用本領(lǐng)域常見的技術(shù)進(jìn)行RNA提取和cDNA合成。 陽15引定量實(shí)時PCR(qRT-PCR):使用化qMan基因表達(dá)測定，根據(jù)制造商的說明書（應(yīng) 用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems))測定mRNA。用于BPTF、HPRT1、CCND2、B化-XL TWISTl、RAB14、CEBPB、CHI3L1、D化3、0LIG2、PDGFRAW及B化2 的haMan探針購自應(yīng)用生 物系統(tǒng)公司（加利福尼亞州的福斯特城（FosterCity,CA))。
[0154] 細(xì)胞活力、集落形成、細(xì)胞周期分析、W及BRAF抑制劑處理：如所述，使用本領(lǐng) 域常見的技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞活力和集落形成并且進(jìn)行細(xì)胞周期分析。將細(xì)胞用不同濃度 的威羅菲尼處理72小時或用達(dá)拉菲尼（印第安納州印第安納波利斯的化emitek公司 (Qiemitek,Indianapolis, 1腳）處理48小時或處理指示的時間。使用DMS0作為媒介物。 [0K5]蛋白質(zhì)印跡分析：進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。通過使用W下特異性抗體來檢 測祀蛋白：針對BPTF的抗體（德克薩斯州蒙哥馬利郡的Bet^lUboratories公 司）、針對B化2和GAPDH的抗體（加利福尼亞州圣克魯斯的圣克魯斯生物技術(shù)公司 (SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA))、W及針對邸K1/2、祀服 1/2、CCND2、 B化-XLP90RSK的抗體（馬薩諸塞州丹弗斯的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司（CellSignaling Technology,Danvers,MA))。 陽156] 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和穩(wěn)定細(xì)胞產(chǎn)生：將被克隆到pLKOl載體中的所選擇的shRNA連同含 有GAG/POLREVW及VSVG基因的表達(dá)載體一起共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后48小時之 時收集慢病毒。將亞匯合的人類黑色素瘤或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞在8yg/ml的聚凝胺存在下 用每一種所收集的慢病毒感染，并且在感染后48小時之時在它們對應(yīng)的培養(yǎng)基中在1yg/ ml的嚷嶺霉素中選擇。將B16-F10細(xì)胞用BPTFshRNAl、BPTFshRNA2或化gshRNA載體 轉(zhuǎn)染并且使用2yg/ml的嚷嶺霉素選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。 陽157] 侵襲測定：使用常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行腫瘤侵襲的基質(zhì)膠測定。對于B16-F10U205-LU W及C8161. 9細(xì)胞，將插入腔室涂覆W15y1的6mg/ml蛋白質(zhì)的的基質(zhì)膠，對于C8161. 9 細(xì)胞，將插入腔室涂覆W17iil的7mg/ml蛋白質(zhì)的基質(zhì)膠，并且對于1205-Lu和U251細(xì)胞 系，將插入腔室涂覆W15y1的5mg/ml蛋白質(zhì)的基質(zhì)膠。
[0158]DNA酶I敏感性的定量：將細(xì)胞收集并且重懸在冰冷的裂解緩沖液（lOOmMK化、 50mMTris-化[pH7. 9]、50% [體積 / 體積]甘油、200mMP-琉基乙醇、W及 5mMMgCU中 并且解育10分鐘。通過在4°C將懸浮液W13,OOOg離屯、15分鐘并且將細(xì)胞重懸在緩沖液 A(50mMTris-Cl[抑 7. 9]、3mMMgCl2、〇. 2mM苯甲基橫酷氣、lOOmM化C1、W及ImM二硫蘇糖 醇）中來將核從裂解的細(xì)胞中回收。在室溫下在緩沖液A中將核用DNA酶I消化3分鐘。 然后用蛋白酶K處理樣品并且使用QIAGENPCR純化試劑盒（加利福尼亞州瓦倫西亞的快 而精公司（Qiagen，Valencia,CA))回收DNA。使用B化2和B化-XL的特異性引物對DNA酶 處理過的DNA進(jìn)行qPCR。 陽159]組織陣列和免疫染色：所利用的組織微陣列是先前使用從石蠟塊獲取的1. 0mm的 核屯、直徑而形成的。由福爾馬林固定的組織微陣列制備載片并且將所述載片用1:100稀 釋的抗人類BPTF抗體（德克薩斯州蒙哥馬利郡的BethylL油oratories公司）染色。在 lOmM巧樣酸鹽緩沖液（pH6.0)中進(jìn)行微波抗原修復(fù)。使用3% &〇2封閉內(nèi)源性過氧化酶， 并且使用正常兔血清進(jìn)行另外的封閉。將一抗在含1. 0%BSA的PBS中稀釋并且在4°C施 用過夜。通過使用生物素標(biāo)記的抗山羊IgG和親和素-生物素（加利福尼亞州伯林格姆的 VectorL油oratories公司（VectorL油oratories,Burlingame,CA))，繼而使用二氨基聯(lián) 苯胺來觀測抗體染色。使用蘇木精將切片復(fù)染色。
[0160] 對免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行的數(shù)字評價：使用MiraxMIDI高分辨率掃描系統(tǒng) (德國耶拿的卡爾蔡司顯微成像公司（CarlZeissMicroImaging,Jena,Germany))拍 攝組織微陣列切片的整個載片圖像。經(jīng)由軟件，使用具有ZeissPlan-Apopc虹omat 20X/.8NA物鏡（德國奧伯科亨的卡爾蔡司光電子有限公司（CarlZeiss化tronics GmBli,0berkochen,Germany))的MarlinCCD照相機(jī)（德國的AlliedVisionTechnologies 有限公司）來控制數(shù)字化過程而W0.32微米/像素的分辨率生成圖像。將具有可鑒定的 黑色素細(xì)胞病變的區(qū)域選用于評價，并且通過使用識別核（蘇木精染色）和細(xì)胞質(zhì)（棟色 免疫染色）的兩種不同的相位測量遮罩來施加分割特征W計算免疫組織化學(xué)染色。通過計 算機(jī)輔助的顏色分割進(jìn)行圖像分析W確定表現(xiàn)陽性顏色的像素的百分比。對于每一個陽性 像素，計算強(qiáng)度（被定義為紅色值、綠色值W及藍(lán)色值的平均值）W用于后續(xù)的分析。用于 評估各種預(yù)后因素對黑色素瘤結(jié)果的意義的統(tǒng)計方法先前有所描述度a曲eri等，2006)。
[0161] 基因表達(dá)譜分析：使用RNeasy試劑盒（加利福尼亞州瓦倫西亞的快而精公司 (Qiagen，Valencia,CA))從細(xì)胞提取總RNA。通過使用與切3或切5的N-徑基班巧酷亞胺基 醋（賓夕法尼亞州匹茲堡的AmershamF^harmacia公司（AmershamPharmacia,Pittsbur曲， PA))連接的SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶（英杰公司）進(jìn)行寡脫氧胸巧酸（oligo(dT))引發(fā)的 聚合來將十微克的總RNA連同通用小鼠參考RNA(加利福尼亞州圣克拉拉的Stratagene公 司（Stratagene,SantaClara,CA)) -起轉(zhuǎn)化成氨基締丙基修飾的cDNA，然后如所述化aqq 等，2005)與微陣列載片雜交。在線性歸一化、log(底數(shù)2)變換、W及受監(jiān)督的層次聚類 之后，將所得的聚類數(shù)據(jù)表輸入到微陣列軟件包的顯著性分析中。選擇5來限制輸出基因 列表，W使得將包括5%的預(yù)測假陽性。 陽16引FISH和顯微鏡法：使用BAC克隆RP11-304114、RP11-1134M2、RP11-29C18W及CTD-2314M10來檢測17q24. 3上的BPTF基因座（2009年2月UCSC基因組瀏覽器凍 結(jié)，ht化://genome.UCSC.e化）。所有克隆均是從奧克蘭研究所的兒童醫(yī)院煙lil化en's HospitalofOaklandResearchInstitute,CHORI)獲得的。使用大構(gòu)建體試劑盒 化arge-Constructkit)(加利福尼亞州瓦倫西亞的快而精公司）制備BACDNA并且如 (Wiegant和Raap，2001)所述，將所述BACDNA通過切口平移而用AlexaFluor488加TP(紐 約州綠島的分子探針公司（Mole州larProbes,GreenIsland,NY))標(biāo)記。在組織分析之 前，通過與正常的中期伸展物與可商購獲得的用于染色體17的著絲粒探針（科羅拉多州 拉斐特的化enbiosystems公司）的組合雜交來驗(yàn)證所有探針的質(zhì)量和定位。如先前所述 (Wiegant和Raap, 2001