一種利用ssr分子標(biāo)記篩選小麥近似品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種篩選小麥近似品種的方法，屬于農(nóng)業(yè)的小麥育種與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥屬于禾本科的小麥屬，它是世界上最早栽培的農(nóng)作物之一。我國于1997年開 始實施植物新品種保護制度。根據(jù)中國《植物新品種保護條例》規(guī)定，植物新品種必需具備 特異性，一致性和穩(wěn)定性（簡稱DUS)才能授予品種權(quán)。近年來，隨著中國植物育種者品種 權(quán)意識的不斷增強，申請保護的植物新品種數(shù)量逐年增長。不僅如此，農(nóng)業(yè)部《主要農(nóng)作物 品種審定辦法》要求，申請審定的小麥品種必須具備特異性，一致性和穩(wěn)定性。
[0003] 特異性測試是DUS測試的重點和難點。特異性是指申請品種應(yīng)當(dāng)明顯區(qū)別于申請 日以前所有已知的同屬或同種品種。為鑒定一個小麥品種具備特異性，需要證明該品種不 同于已知的每個小麥品種。已知的小麥品種數(shù)以萬計，將每一個申請DUS測試的品種（"申 請品種"）與這些品種進(jìn)行田間種植比較，實踐上是不可行的。為此，需要通過一些篩選機 制將那些不需要種植即可知道與申請品種明顯不同的品種排除，只種植那些不確定與申請 品種是否有明顯差異的品種，即近似品種。因此，近似品種的選擇又是特異性測試的關(guān)鍵環(huán)
[0004] 目前，近似品種的篩選主要通過已知品種的地理來源、類型和分組性狀進(jìn)行。測試 機構(gòu)首先建立已知品種的表型性狀數(shù)據(jù)庫，利用品種地理來源、品種類型和分組性狀逐個 排除差異明顯的品種，最后篩選出近似品種。該方法的有以下幾個缺點：⑴小麥已知品種 數(shù)量眾多，品種類型和分組性狀少，育成品種相似度高，大量申請品種篩選出幾十甚至上百 個近似品種，降低了試驗精確度，加大了試驗成本；(2)測試機構(gòu)需要事先知道申請品種的 分組性狀數(shù)據(jù)，往往申請人不能提供準(zhǔn)確的分組性狀數(shù)據(jù)，導(dǎo)致近似品種篩選錯誤，測試機 構(gòu)需要另外耗費一個生長周期的時間采集分組性狀數(shù)據(jù)，消耗大量的時間，勞力和財力。
[0005] 本發(fā)明申請人自己的專利201310119954. X公開了一種小麥SSR指紋圖譜構(gòu)建方 法，該專利的主要目的是利用25對熒光標(biāo)記引物構(gòu)建指紋圖譜，然后根據(jù)品種間差異位點 數(shù)來鑒定是否是相似品種。申請人后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)采用上述方法鑒定近似品種存在以下問 題有待進(jìn)一步改進(jìn)：（1)位點差異法不能精確描述品種間不同類型位點的遺傳差異（例如， 一個雜合位點與純合位點間的位點差異與兩個純合位點間的差異，使用位點差異時是相同 的）；（2)位點差異法的判定為：品種間差異位點數(shù)〈3為近似品種；因此位點差異法對分子 數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性要求極高，在實踐中需要大量投入才能達(dá)到；（3)同時該專利中采用的分子 標(biāo)記數(shù)偏少，用其進(jìn)行篩選近似品種準(zhǔn)確性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種利用SSR分子標(biāo)記篩選小麥近似 品種的方法。該方法在小麥每對染色體上選用2個SSR分子標(biāo)記，共選用了 42個分子標(biāo)記， 根據(jù)遺傳距離來篩選近似品種，該方法高效、準(zhǔn)確。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種利用SSR分子標(biāo)記篩選小麥近似品種的方法，其特征 是，
[0008] (1)提取供試品種DNA ;
[0009] (2)用21對基本核心SSR熒光標(biāo)記引物和21對擴展核心SSR熒光標(biāo)記引物分別 對供試品種模板DNA進(jìn)行PCR擴增；
[0010] 所述 21 對基本核心 SSR 熒光標(biāo)記引物為 Xgwm357-1A、Xbarc61-1B、Xgdmlll-1D、 Xbarc5_2A、Xgwm429_2B、Xcaul5_2D、Xgwml55_3A、Xcau5_3B、Xgwml61_3D、Xgwm610_4A、 Xgwm513-4B、Xcfd84-4D、Xcfa2155-5A、Xbhwl29-5B、Xcfd8-5D、Xgwm570-6A、Xbarcl4-6B、 Xcfd76-6D、Xgpw2269-7A、Xwmc73-7B、Xgwm428-7D，其核苷酸序列依次如序列表 SEQ ID No. 1~42所示；
[0011] 所述 21 對擴展核心 SSR 熒光標(biāo)記引物為 Xcfa2153-1A、Xbarc81-1B、Xcfd28-1D、 Xgwm445_2A、Xbarc7_2B、Xgwm296_2D、Xgwm2_3A、Xgwm566_3B、Xgwm341_3D、Xcau2_4A、 Xgwm495_4B、Xbarcl05_4D、Xbarcl-5、Xbarc4_5B、Xgdm43_5D、Xgwm617_6A、Xgwm219_6B、 Xcfd33-6D、Xcfa2123-7A、Xgwm344-7B、Xgwm44-7D ;其核苷酸序列依次如序列表 SEQ ID No. 43~84所示。
[0012] (3) PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測采集數(shù)據(jù)；
[0013] (4)利用PowerMarker對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到品種之間的遺傳距離，遺傳距 離小于0.2的判定為近似品種。
[0014] 上述步驟（1)-(3)的具體步驟同專利201310119954. X。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：（1)本發(fā)明利用42對分子標(biāo)記引物對小麥品種進(jìn)行擴增、 分析得到大量的分子數(shù)據(jù)，分別計算品種兩兩之間的分子距離。兩者相比較，當(dāng)遺傳距離 多0. 2時，所有成對品種之間都有明顯差異，最終確定與申請品種的遺傳距離小于0. 2的已 知品種為近似品種，這樣只把遺傳距離小于0. 2的品種在田間種植，減少了大量的時間，勞 力和財力；提高了試驗精確度，降低了試驗成本；（2)與專利201310119954. X采用位點差異 篩選近似品種相比，分子距離法選用的閾值更為寬松，同時不會大量增加近似品種的數(shù)量； 因選用的分子距離閾值足夠大，可以允許一定程度的分子數(shù)據(jù)錯誤的存在，而不影響特異 性測試結(jié)果；(3)小麥共有3個基因組21對染色體，為了更好的代表小麥品種間的遺傳變 異，選用的SSR分子標(biāo)記盡可能的均勻分布到不同的染色體組上，本發(fā)明在小麥每對染色 體上選用2個SSR分子標(biāo)記；分子標(biāo)記的數(shù)量多，分布均勾，對染色體覆蓋更完整，更好的反 映品種間的遺傳變異差異；本發(fā)明基于本發(fā)明42個分子標(biāo)記計算出的遺傳距離和品種間 的表型距離相關(guān)性更強，更有利于近似品種篩選的準(zhǔn)確性，嚴(yán)謹(jǐn)性；篩選結(jié)果更可靠；篩選 出的近似品種數(shù)量更少；進(jìn)一步降低了特異性測試的成本；提高了實驗的精確度。
【具體實施方式】
[0016] 1、提取供試品種樣品的DNA
[0017] 米用CTAB法提取供試品種（如表1所不的36份申請品種和如表2所不的99份 已知品種）的DNA，提取方法同專利201310119954. X。
[0018] 表1 36份申請品種
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[0020] 表2 99份已知品種
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[0023] 2、核心引物選擇
[0024] 小麥共有21對染色體，本發(fā)明在小麥每對染色體上選用2個SSR分子標(biāo)記，共選 用了 42個分子標(biāo)記；通過分析引物在染色體上的分布、多態(tài)性水平、PCR擴增穩(wěn)定性和擴增 產(chǎn)物帶型，選擇了能夠同時滿足普通變性膠電泳檢測和毛細(xì)管熒光檢測兩種技術(shù)平臺的引 物共42對，作為小麥品種鑒定的核心引物（表3-4)。
[0025] 表3 21對核心引物
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[0029] 3、利用42對SSR引物對供試品種進(jìn)行PCR擴增