一種殼寡糖的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種殼寡糖的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 幾丁質（chitin)廣泛存在與甲殼類動物的外殼、昆蟲的甲殼和真菌的胞壁中，是 自然界中最為豐富的天然高分子，含量僅次于纖維素。幾丁質具有多種功能特性，但是其極 差的水溶特性和生物降解能力極大的限制了其廣泛應用。相對于幾丁質不溶于水、稀酸、稀 堿、乙醇或其他有機溶劑的特性，殼聚糖（chitosan)可溶于水并在稀酸溶液中呈現出較高 的粘度。這種溶解特性也限制了殼聚糖在生物領域的應用。同樣作為幾丁質降解產物，殼寡 糖（chitosanoligosaccharides，C0S)的溶解性更好，且在生理條件下粘度較低，這是由于 殼寡糖的糖鏈更短和游離氨基基團。殼寡糖的糖苷殘基重復單元中含有一個氨基基團和兩 個羥基基團，是自然界中唯一帶正電荷陽離子堿性氨基低聚糖。殼寡糖的這些特性引起了 越來越多研究者的關注。已經有很多文獻報道了殼寡糖的生物活性，抗氧化、消炎、拮抗微 生物、降低膽固醇和增強免疫活性、抗腫瘤的活性等。殼寡糖在很多領域的應用也有相應的 報道，如食品、藥物、農業(yè)和環(huán)境領域。此外，殼寡糖良好的生物相容性、無毒、對活體器官的 不致敏特性，也使其作為納米_/微米體系發(fā)展成為一種潛在的藥物載體和組織工程支架。 [0003]腫瘤是危害人類健康最嚴重的一類常見病、多發(fā)病。腫瘤已成為世界各地發(fā)病率 和死亡率的一個重要原因，近些年來隨著人們生活方式的改變以及環(huán)境污染的加劇，其發(fā) 病率呈逐年上升趨勢，特別是發(fā)展中國家。目前，我國腫瘤的發(fā)病率為285. 91/10萬，平均 每天每分鐘就有6人被診斷為惡性腫瘤。WHO預測，到2030年估計全球有2014萬新增癌癥 病例，每年將有1320萬患者死于癌癥。有文獻報道，殼寡糖具有抗腫瘤的生物活性，其機制 為直接抑制腫瘤細胞的生長，并且有報道細胞壞死和凋亡，減少腫瘤血管生成從而實現抑 制腫瘤細胞轉移，也有可能是通過增強機體免疫力，間接實現拮抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
[0004] 殼寡糖的體內外抗腫瘤活性研究很多，但是其分子機理仍為未知。殼寡糖具有很 好的粘附特性，可以與哺乳動物細胞的表面糖蛋白結合。因此，殼寡糖帶正電的特性改變了 細胞膜帶電性，從而破壞細胞完整性，影響細胞生長。Suzuki等人發(fā)現抗腫瘤藥物與腫瘤細 胞的靜電相互作用是殼寡糖具有抗腫瘤活性的重要原因。Huang等人使用具有不同電荷數 殼寡糖對三株腫瘤細胞系的拮抗作用，結果表明帶電荷量高的殼寡糖衍生物可以顯著降低 腫瘤細胞的存活率。
[0005] 除了電荷的影響，Huang等人又發(fā)現殼寡糖的分子量對其抗腫瘤活性也發(fā)揮著重 要作用。Salah等人測定了幾丁質、殼聚糖、小分子幾丁質對人源腫瘤細胞THP-I的拮抗作 用，發(fā)現小分子幾丁質的抗腫瘤效果較好，并隨著分子量降低抗腫瘤效果增加。
[0006] 血管生成為腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展和轉移提供了代謝產物、氧和營養(yǎng)物質，因此被 認為是抗腫瘤研究中新型作用靶點。殼寡糖可以抑制人源纖維肉瘤組織中基質金屬蛋白酶 (matrixmetalloproteinase-9，MMP_9)的表達，這在腫瘤轉移發(fā)生具有重要的影響。MMP-9 的上調會促進基質中血管內皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)釋 放和血管生成。VEGF刺激上皮細胞擴增和迀移，這對血管祖細胞和血管新生具有調控作用。Wu等人采用幾種不同的生物方法測定了一些殼寡糖組分對血管生成的抑制作用，發(fā)現抑制 效果取決于組分的脫乙酰度和聚合度。
[0007] 此外，殼寡糖的免疫增強活性也是其具有抗腫瘤活性的重要原因之一。Suzuki等 人利用水溶性較好的殼聚糖增強了免疫能力，并且證明殼寡糖隨著免疫活性增強抑制了腫 瘤增長。還有人認為殼寡糖不能直接殺傷腫瘤，而是通過促進淋巴因子的釋放促進T-淋巴 細胞擴增發(fā)揮腫瘤拮抗活性。Suzuki等人也證實殼寡糖通過激活淋巴細胞釋放淋巴因子來 抑制腫瘤生長。一般來說，免疫增強劑通過增強巨噬細胞或中性粒細胞的免疫活性發(fā)揮非 特性免疫活性的。大多數免疫增強劑刺激如干擾素、白介素和配體蛋白等免疫反應化合物 的分泌，這些化合物在與巨噬細胞或淋巴細胞表面受體蛋白結合后便會激活免疫系統(tǒng)。一 些免疫增強劑可與感染組織靶點細胞上特異受體分子競爭性結合。殼聚糖低聚物可有效促 進巨噬細胞的迀移活性，這是因為巨噬細胞具有趨化性。Ma等人認為殼聚糖低聚物通過下 調MAPK和PI3K/Akt信號通路磷酸化和NF-KB和AP-I的激活進而抑制IL-6和TNF- a的 分泌發(fā)揮了抗炎癥活性。殼寡糖還通過增強抗體應答發(fā)揮免疫增強活性的。Chang等人研 究了殼寡糖對一種未滅活的流感疫苗的作用效果。結果表明殼寡糖明顯提高了血清中的抗 體含量，增強了小鼠的抗病毒防御系統(tǒng)。殼寡糖還能刺激細胞因子的釋放，如白介素IL-I0 和腫瘤致死因子TNF-a等。
[0008] 但現有的殼寡糖在抑制腫瘤上活性欠佳，并且根據已有的國內外參考文獻來看， 殼寡糖體內腫瘤拮抗作用的給藥方式和給藥劑量的研究尚為空白，殼寡糖對多腫瘤細胞株 抑制篩選的工作鮮有報道。因此制備出活性好的殼寡糖，在制備抑制腫瘤藥物上有著良好 的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明提供一種殼寡糖的制備方法及其應用。
[0010] -種殼寡糖的制備方法，具體是按照以下步驟制備的：
[0011] 將殼聚糖溶解于質量濃度為〇. 1~5. 0%的冰乙酸溶液中，然后加入殼聚糖5~ 25倍重的濃度為10%~40%過氧化氫，升溫攪拌至40~90°C恒溫，反應0. 5~10h，再經 質量濃度為60~100%的乙醇沉淀，過濾，濾渣經過干燥，得到聚合度2~30的殼寡糖；其 中殼寡糖中聚合度2~10的含量不低于80%，不包含水分含量的殼寡糖純度>98% ;殼聚 糖與質量濃度為〇. 1~5. 0%的冰乙酸溶液的質量體積比為Ig: (10~30)mL。
[0012] -種殼寡糖的應用是指用于制備抑制5種人源腫瘤的10株腫瘤細胞的藥物。
[0013] 本發(fā)明不僅可有效提高豐富的自然資源的利用率，還有效利用了其生物相容性和 腫瘤拮抗活性。通過分析殼寡糖的抗腫瘤活性，有助于拖動抗腫瘤藥劑發(fā)展。在相同測試 濃度范圍內本發(fā)明的殼寡糖對HCT-116和A549的殺傷能力均高于市售殼寡糖；在相同測試 濃度范圍內陽性藥5-氟尿嘧啶對十種不同來源的人源腫瘤細胞系的半數抑制濃度變化范 圍為0. 04±0. 01~12. 1 ±3. 0yg/mL，本發(fā)明制備的殼寡糖對腫瘤細胞系的半數抑制濃度 變化范圍為48. 6±7. 0~1329. 9±93. 4yg/mL。殼寡糖對于十種不同來源的人源腫瘤細胞 系的最大抑制率均可達到90%以上，甚至高達95%。本發(fā)明制備的殼寡糖體內外殺傷腫瘤 的效果好。
【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例1制備的殼寡糖與三種商用殼寡糖對人源肺癌腫瘤細胞A549生長 抑制效果圖（n= 4, 土sd);其中a為COS，b為COS-a，c為COS-b，d為COS-c;
[0015] 圖2為實施例2制備的殼寡糖與三種商用殼寡糖對人源結腸癌細胞HCT-116生長 抑制效果圖（n= 4, 土sd);其中a為COS，b為COS-a，c為COS-b，d為COS-c;
[0016]圖3為實施例4制備的殼寡糖灌胃給藥對小鼠肉瘤S180移植瘤的抑制效果圖（月中 瘤體積）（n= 10, 土sd);其中a為空白對照組，b為低劑量組，c為高劑量組；
[0017]圖4為實施例4制備的殼寡糖灌胃給藥對荷瘤小鼠相對體重的影響；其中a為空 白對照組，b為低劑量組，c為高劑量組；
[0018]圖5為實施例5制備的殼寡糖灌胃給藥對小鼠肉瘤S180殘瘤的抑制效果圖（月中 瘤體積）（n= 7, 土sd);其中a為空白對照組，b為低劑量組，c為高劑量組；
[0019]圖6為實施例5制備的殼寡糖灌胃給藥對荷瘤小鼠相對體重的影響；其中a為空 白對照組，b為低劑量組，c為高劑量組；
[0020] 圖7為實施例6制備的殼寡糖腹腔注射給藥對小鼠肉瘤S180殘瘤的抑制效果圖 (腫瘤體積）（n= 10，土sd);其中a為空白對照組，b為黃芪對照組，c為低劑量組，d為高 劑量組；
[0021] 圖8為實施例6制備的殼寡糖腹腔注射給藥對殘瘤小鼠相對體重的影響；其中a 為空白對照組，b為黃芪對照組，c為低劑量組，d為高劑量組。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉的【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】之 間的任意組合。
【具體實施方式】 [0023] 一：本實施方式一種殼寡糖的制備方法，具體是按照以下步驟制備 的：
[0024] 將殼聚糖溶解于質量濃度為0. 1~5. 0%的冰乙酸溶