自催化atrp制備血紅蛋白印跡聚合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種血紅蛋白印跡聚合物的制備方法，尤其是一種無需過渡金屬催化劑的自催化ATRP制備血紅蛋白印跡聚合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血紅蛋白是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的一種重要蛋白質(zhì)，它參與血液中CO2的運(yùn)輸以及血液pH值的調(diào)節(jié)，臨床上，血紅蛋白的檢測可為心血管疾病、肺部疾病、某些腫瘤疾病等提供診斷依據(jù)，因此，靈敏、準(zhǔn)確檢測血清中血紅蛋白含量具有重要意義。
[0003]目前血紅蛋白的常用檢測方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法以及分子印跡技術(shù)等，放射免疫分析法及酶聯(lián)免疫分析法需要制備抗體，利用血紅蛋白與其抗體發(fā)生的特異反應(yīng)(即免疫反應(yīng))進(jìn)行檢測?？贵w制備周期長，尤其是單克隆抗體價(jià)格十分昂貴，同時(shí)，放射免疫分析需要特殊實(shí)驗(yàn)室，對操作人員身體損傷嚴(yán)重，而酶聯(lián)免疫分析耗時(shí)較多。分子印跡技術(shù)是一種新型高效分離技術(shù)，其分離作用來源于分子印跡聚合物(molecularlyimprinted polymers,MIP)所具有的類似天然抗體或酶的分子識別功能。與前兩種分析方法相比，具有適應(yīng)性強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性高、對壓力、溫度極具耐受性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，MIP的制備簡單，重復(fù)性好，因此近年來發(fā)展迅速，在色譜分離、固相萃取、催化合成、免疫測定等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
[0004]分子印跡技術(shù)的核心是MIP的制備，現(xiàn)有的制備方法是通過模板分子與功能單體相互作用(如氫鍵、范德華力、靜電作用等)形成復(fù)合物，在引發(fā)劑的作用下使功能單體、交聯(lián)劑聚合形成具有適當(dāng)剛性的聚合物，最后在一定條件下除去模板分子，聚合物中就形成了與模板分子大小、空間結(jié)構(gòu)、電荷分布等多重互補(bǔ)的空穴，從而對模板分子具有識別選擇性?！盎钚浴?可控自由基聚合是目前高分子科學(xué)中非常活躍的研究領(lǐng)域，原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)是實(shí)現(xiàn)“活性”/可控聚合的有效手段，它以有機(jī)鹵化物為引發(fā)劑，低價(jià)態(tài)過渡金屬配合物(除常見的Cu外，還包括Fe、Co、Ti等的配合物)為鹵原子載體(過渡金屬催化劑)，通過氧化還原反應(yīng)，在活性種與休眠種之間建立動態(tài)平衡，可以對聚合物的端基、組成、結(jié)構(gòu)、分子量等進(jìn)行有效控制；同時(shí)，ATRP能夠?qū)崿F(xiàn)水相、室溫、一定pH下的表面引發(fā)、原位聚合等?？梢姡呋瘎┦茿TRP體系的重要組成部分，它決定著休眠種與活性種之間可逆轉(zhuǎn)化反應(yīng)的平衡。目前已有將三電極體系引入ATRP的相關(guān)報(bào)道，所公開的操作方法如下:將引發(fā)劑修飾電極作為工作電極，工作電極與參比電極、對電極構(gòu)成三電極體系；將此三電極體系放入由功能單體、交聯(lián)劑、模板分子以及低價(jià)態(tài)過渡金屬配合物配制成的溶液中，在工作電極與參比電極之間恒定電勢一定時(shí)間，得到聚合物；再用洗脫液洗脫模板分子并脫除催化劑，得到印跡聚合物。
[0005]然而，如采用現(xiàn)有ATRP方法制備蛋白質(zhì)MIP，則存在如下問題:
1.所需的低價(jià)態(tài)金屬配合物對空氣等敏感而不易保存；
2.所需的低價(jià)態(tài)金屬配合物對蛋白質(zhì)等生物大分子具有一定的毒性；
3.脫除催化劑的后處理工藝比較復(fù)雜，加大制備成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種不需過渡金屬催化劑的自催化ATRP制備血紅蛋白印跡聚合物的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種自催化ATRP制備血紅蛋白印跡聚合物的方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行:
a.將含溴化合物修飾電極作為工作電極，所述工作電極與參比電極、對電極構(gòu)成三電極體系；
b.將所述三電極體系放入由功能單體、交聯(lián)劑和血紅蛋白分子配制成的溶液中，在工作電極與參比電極之間施加-0.3?-0.8V恒定電勢60?240min，得到血紅蛋白聚合物；
c.用洗脫液洗脫血紅蛋白分子，得到血紅蛋白質(zhì)印跡聚合物。
[0008]本發(fā)明利用血紅蛋白的含鐵性質(zhì)，通過電勢控制血紅蛋白中鐵的價(jià)態(tài)，使其作為模板分子的同時(shí)作為催化劑，無需另外添加過渡金屬催化劑，解決了現(xiàn)有ATRP技術(shù)應(yīng)用于血紅蛋白印跡聚合物制備時(shí)所存在的低價(jià)態(tài)金屬催化劑對空氣等敏感而不易保存，催化劑對蛋白質(zhì)等生物大分子具有一定的毒性以及脫除催化劑后處理工藝比較復(fù)雜等問題。本發(fā)明所制備的印跡聚合物具有較好的識別性，并可利用電化學(xué)方法對血紅蛋白實(shí)現(xiàn)較好的檢測。
【附圖說明】
[0009]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的原理及過程示意圖。
[0010]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的不同電極在含有0.lmmol/L的[Fe (CN)6]3 /4的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安圖。
[0011]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的不同電極在含有0.lmmol/L的[Fe(CN)6]3 /4的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的電化學(xué)交流阻抗圖。
[0012]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1血紅蛋白印跡聚合物修飾電極表面。
[0013]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的印跡聚合物修飾電極對1.0X 10 mg/mL血紅蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸的選擇性示意圖。
[0014]圖6為本發(fā)明實(shí)施例1的印跡聚合物修飾電極的示差脈沖伏安法(DPV)響應(yīng)電流變化值與血紅蛋白濃度的關(guān)系示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1:
首先按照現(xiàn)有技術(shù)，利用引發(fā)劑-含溴化合物修飾電極表面，然后按照以下步驟進(jìn)行:
a.將含溴化合物修飾金電極作為工作電極，飽和甘汞電極做參比電極、鉑電極做對電極，所述工作電極與參比電極、對電極構(gòu)成三電極體系；
b.將所述三電極體系放入由0.28g丙烯酰胺、0.093g N，N-亞甲基異丙烯酰胺和
0.019g血紅蛋白分子配制成的溶液中，在工作電極與參比電極之間施加恒定電勢-0.6V，施加 240min ；
c.將所述工作電極放入10%(v/v)醋酸與10%(v/v)十二烷基硫酸鈉溶液組成的洗脫劑中，浸泡120min，洗脫血紅蛋白分子得到血紅蛋白印跡聚合物。
[0016]工作原理:
從分子結(jié)構(gòu)來看，每一血紅蛋白分子由四分子的珠蛋白和四分子亞鐵血紅素組成，每個(gè)血紅素又由4個(gè)吡咯環(huán)構(gòu)成，在吡咯環(huán)中央有一個(gè)鐵原子，通常，這個(gè)鐵原子是三價(jià)態(tài)的。本發(fā)明利用三電極體系(工作電極、參比電極、對電極)，通過調(diào)節(jié)工作電極(溴化物修飾電極)的電勢還原血紅蛋白中的三價(jià)鐵為二價(jià)鐵，使血紅蛋白作為模板蛋白質(zhì)的同時(shí)，成為鐵基催化劑，進(jìn)而引發(fā)功能單體、交聯(lián)劑聚合，制備血紅蛋白分子印跡聚合物。
[0017]具體工作過程及原理如圖1所示。
[0018]圖2為實(shí)施例1的不同電極在含有0.lmmol/L的[Fe (CN)6]3 /4的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安圖，掃速為100mV/S，右圖是左圖中間曲線的放大圖。圖2中曲線a為裸金電極，b為溴化物修飾金電極，c為血紅蛋白催化聚合后的聚合物修飾金電極，d為洗脫了血紅蛋白質(zhì)的印跡聚合物修飾電極。
[0019]從圖2中可以看出裸金電極的CV曲線出現(xiàn)了一對較為對稱的氧化還原峰(曲線a)，說明[Fe(CN)6]3/4在電極上的反應(yīng)是準(zhǔn)可逆的；裸金電極表面被溴化物修飾后，其氧化還原電流有了明顯的降低(曲線b)，說明溴化物已成功組裝到電極表面上；實(shí)施聚合