一種藏藥綠蘿花中銀椴苷的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥有效成分的提取純化方法，具體是涉及一種從藏藥綠蘿花中提取 銀椴苷苷的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藏藥綠蘿花ayrei/61)為瑞香科結(jié)香屬植物，其花蕾似松球，表面披 著一層淡綠的茸毛，為喜馬拉雅山脈高寒地區(qū)特有珍貴草本藥材，性微寒，采其花蕾陰干泡 水，主治糖尿病、冠心病、高血壓和各種血管炎癥等疾病。2011年，太志剛等人從綠蘿花中分 離得到黃酮、三萜和核苷類物質(zhì)，其中，在分離實驗初期就已證明綠蘿花中含有大量銀椴苷 物質(zhì)（云鹿才孝/摩f論丈? 2011，131)。
[0003] 銀椴苷具有較好〇-葡萄糖苷酶抑制活性的藥理活性，2011年Kim等人從沙棘中 分離得到銀椴苷（JArTic. /7OOt/CAeva2011，138)，并發(fā)現(xiàn)其具有較強的a-葡萄糖苷 酶抑制活性；2012年Wan等人從越橘藍莓中分離得到銀椴苷〇￡通.2012，1929)，再 次驗證其具有較強的a_葡萄糖苷酶抑制活性；銀椴苷在綠蘿花中的含量較高，可以推測 銀椴苷是治療糖尿病的主要活性物質(zhì)。另外，銀椴苷還具有廣泛的藥理活性，2010年Sun 等人發(fā)現(xiàn)銀椴苷具有可逆抑制3種人肝細胞色素P450酶的活性2010， 1670) ; 2012年Goto等人證明銀椴苷通過激活脂聯(lián)素提高肝臟脂肪酸從而改善肥胖所導 致的代謝紊亂（J；層/t汾'0.2012，768); 2014年Velagapudi等人發(fā)現(xiàn)銀椴苷具有抑制 神經(jīng)炎癥的生物活性（萬i〇.萬2014，3311);相關(guān)文獻也曾報道銀椴苷具有抗炎、 抗氧化和抗腫瘤及保肝活性。
[0004] 基于銀椴苷較好的藥理活性，開發(fā)其分離方法具有較強的實際意義。文獻和專利 報道了銀椴苷的提取方法，專利（CN102311467A)報道了一種從結(jié)香中分離高純度銀椴苷 的新方法，利用超聲提取、超濾、大孔樹脂層析、高速逆流色譜分離純化得到97%的銀椴苷， 該方法工藝步驟繁瑣，主要工段所使用的超濾膜易堵塞，成本高，高速逆流色譜設(shè)備龐大復 雜、溶劑體系難選，易乳化，溶劑耗量大，分離時間長，對于天然產(chǎn)物復雜體系，高速逆流色 譜不一定能達到常規(guī)生產(chǎn)要求；專利（CN103694293A)報道了一種檻木銀椴苷的提取純化 方法及檢測方法，利用60%乙醇提取、大孔樹脂層析、硅膠柱層析、聚酰胺粉層析、ODS層析、 MCI-gel柱層析等方法，最終分離得到96. 14%的銀椴苷，該方法操作繁瑣，反復使用層析手 段，不易擴大化生產(chǎn)，且層析材料能吸附原料，特別是硅膠材料能達到50%的吸附量，如此 之多的層析手段必然造成生產(chǎn)成本大幅提升，不具備開發(fā)價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種從藏藥綠蘿花中分離和回收銀椴苷 的簡便方法。
[0006] 本發(fā)明將分離和回收高純銀椴苷結(jié)合為一體，提供了一種提取、干法聚酰胺酚柱 層析和結(jié)晶分離銀椴苷的簡便方法，同時還利用助沉淀劑回收固液分離后所剩母液中的水 合和表面活性物質(zhì)包裹的銀椴苷，進一步將分離和回收的銀椴苷合并后重結(jié)晶。
[0007] 本發(fā)明所述從綠蘿花提取液中分離和回收銀椴苷的步驟如下： (1) 將干燥的綠蘿花粉碎至粒徑1_5_，置于熱回流提取罐中，并加入原料質(zhì)量8-10倍 的乙醇溶液，攪拌混勻，50-60°C下回流提取2-3次，過濾，濃縮濾液所得粗提物用45-55°C 熱水分散，冷卻至室溫后用氯仿重復萃取2-3次，氯仿萃取部分備用，剩余水相進一步用正 丁醇重復萃取2-3次，減壓濃縮正丁醇萃取部分至固液比為1:2-1:4,冷卻，硅藻土過濾得 濾液A; (2) 將濾液A與聚酰胺樹脂按30-100g:IL比例混合后，減壓抽干正丁醇溶劑后立即裝 柱，然后用體積比為7:1、5:1、3:1、1:1和0:1的氯仿甲醇混合液依次梯度洗脫，合并氯仿甲 醇5:1和3:1的洗脫部分，加水萃取并回收氯仿后，剩余液體濃縮至無醇味，靜置10-15h，固 液分離，得銀椴苷沉淀物A和母液A; (3) 將母液A加熱至70-80°C，添加助沉淀劑，冷卻，靜置10_15h，固液分離，得銀椴苷沉 淀物B; (4) 合并銀椴苷沉淀物A和銀椴苷沉淀物B，重結(jié)晶、洗滌、60-70°C減壓干燥，即得銀椴 苷。
[0008] 所述重結(jié)晶是用質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇溶液、甲醇、氯仿-甲醇溶液、氯 仿-乙醇溶液或乙酸乙酯-乙醇溶液進行；其中氯仿-甲醇溶液是氯仿和甲醇按體積比 1:1-7:1的比例混合；氯仿-乙醇溶液是氯仿和乙醇按體積比1:1-6:1的比例混合，乙酸乙 酯-乙醇溶液是乙酸乙酯和乙醇按體積比2:1-10:1的比例混合。
[0009] 所述助沉淀劑是甘草酸二胺、甘草酸鉀、甘草酸鈉或甘草次酸胺。
[0010] 所述步驟（1)中乙醇溶液為質(zhì)量百分比濃度為60-70%的溶液。
[0011] 所述聚酰胺樹脂的型號為CXSZ-60、CXSZ-100或CXSZ-120。
[0012] 關(guān)于上述濃縮至固液比是指一定體積溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量與溶液體積的比，g:ml。
[0013] 本發(fā)明是對藏藥綠蘿花中銀椴苷分離和回收的簡便方法，步驟（1)采用熱提取是 為了提高銀椴苷溶解性，增加提取效率，采用水分散和氯仿萃取是為了去除小分子、糖、蛋 白、葉綠素等雜質(zhì)，使用硅藻土過濾機是為了快速除去正丁醇萃取部分中的膠質(zhì)、大分子蛋 白質(zhì)、多糖、懸浮物等雜質(zhì)；步驟（2)所使用聚酰胺樹脂是常見的分離材料，采用干法裝柱 是為使得綠蘿花中的黃酮類物質(zhì)充分吸附在聚酰胺樹脂上，氯仿-甲醇作為梯度洗脫二元 溶劑，因為銀椴苷大多出現(xiàn)在氯仿-甲醇5:1洗脫部分，少部分出現(xiàn)在3:1，所以合并5:1和 3:1洗脫部分，之后加水萃取的原因有2個，其一是將銀椴苷轉(zhuǎn)溶到甲醇水液中更有利于結(jié) 晶，其二是為了回收氯仿。結(jié)晶時濃縮至無醇味是為了最大限度的降低銀椴苷的溶解度，使 其沉淀充分析出。以上提取手段雖然是常規(guī)的，但提取的工藝路線簡單有效，產(chǎn)品純度高， 易擴大化生產(chǎn)，至今沒有文獻和相關(guān)專利報道。
[0014] 步驟（3)中的母液A中還溶解少量的銀椴苷，沒有相關(guān)文獻報道其回收方法。本 發(fā)明提供的方法是在70-80°C時向?qū)⒛敢築中添加助沉淀劑，冷卻，靜置，得銀椴苷沉淀物 B。所添加的助沉淀劑是云南豐產(chǎn)植物甘草中制備得到的甘草酸二胺、甘草酸鉀、甘草酸鈉 或甘草次酸胺，它們在70-80°C時能破壞銀椴苷中酚羥基與水形成氫鍵，減少水化作用，使 銀椴苷析出。另外，植物提取物中存在諸如皂苷類、蛋白質(zhì)、糖類、茶皂素、膽留醇等強表明 活性劑，70-80°C時添加甘草酸類有機鹽能破壞以上表明活性劑對銀椴苷的包裹，使其溶解 度顯著減少，易于析出。
[0015] 本發(fā)明首次將分離和回收綠蘿花中的銀椴苷合為一體，充分利用了綠蘿花藥材資 源，與現(xiàn)有的銀椴苷制備方法有著本質(zhì)的區(qū)別。本發(fā)明提取工藝路線簡單有效，具有極強的 實用性和可操作性，易擴大化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不局限于所述 內(nèi)容。
[0017] 實施例1:本藏藥綠蘿花中銀椴苷的提取方法，具體操作如下： (1) 提取 取干燥的5. 0kg綠蘿花(粒徑為Imm)和40kg乙醇溶液(質(zhì)量百分比濃度為70%)置于 熱回流提取罐中，50°C回流提取3次，過濾，濾液濃縮，得粗提物（613.56g)，粗提物用1.5 kg熱水（45°C)分散，冷卻至室溫后用氯仿萃取2次，氯仿萃取部分備用，剩余水相進一步用 正丁醇重復萃取3次；濃縮正丁醇萃取部分至固液比為1:2,冷卻，硅藻土過濾得濾液A; (2) 聚酰胺樹脂吸附和洗脫 聚酰胺樹脂（GR，CXSZ-60)與濾液A按IL:30g比例混合，減壓抽干正丁醇后干法裝柱， 用體積比7:1、5:1、3:1、1:1和0:1的氯仿甲醇二元溶劑依次梯度洗脫，收集合并5:1和3:1 洗脫部分，加水回收氯仿，剩余液體濃縮至無醇味，靜置l〇h，得銀椴苷沉淀物A(55. 13g)和 母液A; (3) 回收銀椴苷 將母液A加熱至70°C，添加甘草酸鉀，1小時后冷卻，靜置10h，固液分離，得銀椴苷沉淀 物B(7.02g); (4) 重結(jié)晶 合并銀椴苷沉淀物A和銀椴苷沉淀物B，用氯仿-甲醇（4:1)混合液重結(jié)晶、洗滌、60 °(：減壓干燥，得純度90%以上的銀椴苷（36. 67g)，得率為91. 77% ; (5) 銀椴苷含量測定方法體系的建立 采用HPLC檢測藏藥綠蘿花中銀椴苷含量，具體檢測方法如下： 分別稱量1〇〇mg銀椴苷，用甲醇（HPLC級)稀釋并配制成1.00mg/mL的標準貯備液，取 標準貯備液分別制備為0. 01、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、I.OOmg/mL標準使用液，備用。另外， 稱量1. 000g的樣品，用甲醇配制成1. 00mg/mL的樣品溶液，備用。
[0018] 以上配好的溶液經(jīng)0.45ym的過濾膜后注入Agilent1200HPLC系統(tǒng)，色譜柱 為AgilentZORBAXSB-C18 (250mmX4.6, 5ym)，流動相由LO%甲酸水液和甲醇組成 (48 : 52)，流速為0. 8mL/min，柱溫為25°C，UV檢測波長為280nm，進樣量10yl，保留 時間定性，外標法計算相應結(jié)果，結(jié)果見表1。
[0019] 實施例2:本藏藥綠蘿花中銀椴苷的提取方法，具體操作如下： (1)取干燥的5.Okg綠蘿花(粒徑為2mm)和45kg乙醇溶液(質(zhì)量百分比濃度為65 %) 置于熱回流提取罐中，55°C回流提取2次，過濾，濾液濃縮得粗提物（638. 13g)，粗提物用 2.Okg熱水（50°C)分散后，冷卻至室溫后用氯仿萃取3次，氯仿萃取部分備用，剩余水相進 一步用正丁醇重復萃取2次；減壓濃縮正丁醇萃取部分至固液比為1:3,冷卻，硅藻土過濾 得濾液A; (2) 聚酰胺酚材料（GR，CXSZ-60)與濾液A按IL:50g比例混合，減壓抽干正丁醇溶劑 后干法上柱