一種鎳-IgG螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，設(shè)及一種鑲-IgG馨合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002]IgG主要由脾、淋己結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌，W單體形式存在。在個(gè)體發(fā)育過(guò)程 中機(jī)體合成IgG的年齡要晚于IgM，在出生后第3個(gè)月開(kāi)始合成，3~5歲接近成年人水平。 IgG是血清中主要的抗體成分，約占血清總Ig的75 %。IgG是唯一能通過(guò)胎盤(pán)的Ig，在自 然被動(dòng)免疫中起重要作用。此外IgG還具有調(diào)理吞瞻、ADCC和結(jié)合SPA等作用。由于IgG 上述特點(diǎn)，IgG在機(jī)體免疫防護(hù)中起著主要的作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒、抗毒素抗體都屬于 IgG類抗體。應(yīng)用對(duì)麻疹、甲型肝炎等有免疫力的產(chǎn)婦或正常人丙種或胎盤(pán)球蛋白可進(jìn)行人 工被動(dòng)免疫，能有郊地預(yù)防相應(yīng)的傳染性疾病。
[0003]鑲作為一種常見(jiàn)的有毒金屬，廣泛應(yīng)用于生活、生產(chǎn)之中，包括生產(chǎn)硬幣、珠寶、鑲 合金不誘鋼、制造Ni-Cd電池等，與人們的生活息息相關(guān)。隨著科技的進(jìn)步，人們將鑲作為 催化劑用于生產(chǎn)碳納米顆粒的生產(chǎn)之中，又進(jìn)一步加深了鑲對(duì)于人類的影響。對(duì)于普通人 群，鑲主要是通過(guò)食入、飲入、接觸等方式攝入鑲，當(dāng)然吸煙也是一重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò) 量的鑲會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多處組織及器官損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括呼吸系統(tǒng)疾病（肺炎、 支氣管炎、肺纖維化、哮喘、肺水腫等）、屯、血管疾病、腎臟疾病、皮膚疾病等，甚至還會(huì)導(dǎo)致 腫瘤的發(fā)生。
[0004]流行病學(xué)資料顯示，長(zhǎng)期接觸鑲的工人，其患呼吸系統(tǒng)腫瘤的幾率大大增加，并且 其因呼吸系統(tǒng)腫瘤致死的幾率也大大增加。動(dòng)物模型、體外模型試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，鑲可W誘導(dǎo)腫 瘤的發(fā)生。1990年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer, lARC)已將鑲化合物作為第一類致癌物質(zhì)佑roup1)，將金屬鑲作為2B類致癌物質(zhì)佑roup 2B)?？梢?jiàn)，鑲嚴(yán)重威脅人體的健康。
[0005]關(guān)于鑲中毒，特別是慢性鑲中毒的評(píng)價(jià)，僅能通過(guò)檢測(cè)血鑲含量，間接反應(yīng)人體內(nèi) 的循環(huán)鑲含量，無(wú)法進(jìn)一步評(píng)估鑲對(duì)于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展， 鑲與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可W從機(jī)體功能角度評(píng)價(jià)鑲中毒，特別是慢性 鑲中毒對(duì)于機(jī)體的損害程度的評(píng)價(jià)方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)鑲污染嚴(yán)重的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種鑲-IgG馨合物及其制備方 法，并建立鑲-IgG馨合物的定性、定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè)鑲-IgG馨合物在評(píng)價(jià)一個(gè) 地區(qū)鑲污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鑲-IgG馨合物可W間接反映 該個(gè)地區(qū)人群受鑲污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)鑲污染程度。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是；提供一種鑲-IgG馨合物，鑲離子與IgG通過(guò)琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的鑲-IgG馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0009]A)鑲與IgG的馨合反應(yīng)；在人源的IgG中加入鑲離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶 液；
[0010] B)純化鑲-IgG馨合物的提?。徊捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgGW及多余的鑲離子，即得鑲-IgG馨合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下；
[0012] (1)溶解樣品；向經(jīng)過(guò)步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水，使鑲-IgG馨合物 復(fù)溶；
[001引似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgG特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] 做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgG與 填料特異性結(jié)合；
[0015] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[001引 妨收集；收集經(jīng)過(guò)步驟（4)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[0017] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本；
[0018] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鑲特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫；
[0021] (10)收集；收集經(jīng)過(guò)步驟（9)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)性；
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過(guò)夜，收集樣本，即得鑲-IgG馨合物。
[0023] 其中，上述鑲-IgG馨合物的制備方法，還包括步驟C);對(duì)鑲-IgG馨合物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下；
[0025](1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[002引 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的鑲-IgG馨合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0027] 做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0028] (4)檢測(cè)；在膠床上找出含鑲的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶復(fù)溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或化ISA法檢測(cè)是否含有鑲W及檢測(cè)鑲的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的鑲-IgG馨合物在制備檢測(cè)人體內(nèi)鑲-IgG馨合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鑲-IgG馨合物作為對(duì)照品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有可捕獲IgG的蛋白或捕獲金屬 鑲的物質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測(cè)鑲-IgG馨合物的方法，W已知含量的上述的鑲-IgG 馨合物作為對(duì)照品，采用w下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)；酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鑲-IgG馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純鑲-IgG馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鑲-IgG馨合物與電感禪合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0033] 實(shí)施本發(fā)明的鑲-IgG馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成鑲-IgG馨合物；
[00巧]2.本發(fā)明首次提出鑲-IgG馨合物可用于制備檢測(cè)血樣中鑲-IgG馨合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了鑲-IgG馨合物的定性定量檢測(cè)方法，W便定量檢測(cè)鑲-IgG馨合 物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鑲污染程度的應(yīng)用。通過(guò)定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鑲-IgG馨合物 可W間接反映該個(gè)地區(qū)人群受鑲污染的情況，從而間接反映該個(gè)地區(qū)鑲污染程度。本發(fā)明 建立的鑲-IgG馨合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測(cè)的重復(fù)性得到大大提 局。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1為本發(fā)明所述的鑲-IgG馨合物的非變性電泳條帶圖；
[003引圖2為本發(fā)明所述的鑲-IgG馨合物的同步福射X線電泳條帶的巧光分析圖；
[0039] 其中，圖1中，M為Marker, 5為鑲-IgG馨合物；圖2中，橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置， 縱坐標(biāo)為該蛋白條帶中鑲金屬能量。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說(shuō)明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒(méi)有列舉出來(lái)的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過(guò)市購(gòu)方式 獲得：
[0042] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0044] 本發(fā)明中的所述能與IgG特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲IgG的蛋白的娃 膠或樹(shù)脂；
[0045] 本發(fā)明中的能捕獲IgG的蛋白（抗IgG抗體），包括但不限于兔Anti-人類IgG H&L，其品牌為Abeam、型號(hào)為油6715 ;
[0046] 本發(fā)明中的能與鑲特異性結(jié)合的填料，為表面附有能捕獲鑲的物質(zhì)的硅膠或樹(shù) 脂；
[0047] 本發(fā)明中的能捕獲鑲的物質(zhì)，包括但不限于鼠抗NimAb，購(gòu)買自廣州然科公司、貨 號(hào)為服14419 ;
[0048] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0049] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0050]洗漆液為含有KH2PO4O. 2mg/ml、化2冊(cè)〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0051] 封閉液為1% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0052]稀釋緩沖液為含 1. 5mg/mL化2〇)3、2. 93mg/mlNaHC〇3的PH為 9.6的 0. 05M磯酸 鹽緩沖液；
[0053] 酶標(biāo)抗體為HRP酶標(biāo)抗體；
[0054] 終止液為：將21. 7ml的2M&8〇4定容至200ml的d地2〇中；
[005引洗脫液為含l-2mg/ml木瓜蛋白酶的PH為8. 0的0.Imol/LTris-肥L緩沖液；[005引酸化劑為硝酸；
[0057]上樣緩沖液為含有 1MTris-HCl(pH6.8) 15. 5mL、1 %漠酪藍(lán) 2. 5mL、ddH2〇7mL、甘 氨酸 25血的Samplebuffer巧)〇 ;
[0058]電泳緩沖液為含Tris3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH為6.8的d地2〇溶液。
[0059] 本發(fā)明還提供一種鑲-