方案中，染色可發(fā)生于約18°C下持續(xù)約4小時(shí)。在另一實(shí)施方 案中，染色可發(fā)生于約41°C下持續(xù)約30分鐘。
[0061] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，形成包含精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度為約100 μΜ 至約450 μ M的染料的染色混合物，且將該染色混合物在約41 °C的溫度下保持一段時(shí)間。在 另一實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純水包含0. 204g NaHC03、0. 433g KHCOJPO. 473g C6H8O7 · H2O(NaHCC)30.0 97 摩爾 / 升、KHCO3 0· 173 摩爾 / 升、C6H8O7 · H2O 0· 090 摩爾 / 升的 水溶液）。
[0062] 在另一實(shí)施方案中，形成包含精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度為約100 μΜ至約 450 μ M的染料的染色混合物，且將該染色混合物在約28°C的溫度下保持一段時(shí)間。在另一 實(shí)施方案中，該時(shí)間長(zhǎng)度為約3小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑為每25ml純水包含 0· 204g NaHC03、0. 433g 腿0)3和 0· 473g C6H8O7 · H2O(NaHCC)3 0· 097 摩爾 / 升、KHCO3 0· 173 摩爾/升、C6H8O7 · H2O 0· 090摩爾/升的水溶液）。
[0063] (ii)染色細(xì)胞的分選或富集
[0064] 運(yùn)動(dòng)性抑制劑也可用于在精子細(xì)胞分選過(guò)程中使細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)。一般而言，一 旦根據(jù)本發(fā)明將精子染色，可以根據(jù)任何已知的可依據(jù)熒光分離的方法分選之。常用 且公知的方法包括流式細(xì)胞術(shù)體系（如美國(guó)專利號(hào)5, 135, 759、5, 985, 216、6, 071，689、 6, 149, 867及6, 263, 745 ;國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)W099/33956和W001/37655及美國(guó)專利申請(qǐng)系列 號(hào)10/812,351(相應(yīng)的國(guó)際專利公開(kāi)號(hào)WO 2004/088283)中舉例及描述的那些，其每一篇 的內(nèi)容均在此處引用作為參考）。當(dāng)根據(jù)這些方法分選時(shí)，將精子作為樣品液引入流式細(xì)胞 儀的管口中。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品液可包包含染色精子細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)性抑制劑。
[0065] 與之類似，用于在穿行細(xì)胞儀時(shí)包裹樣品液流的鞘液中也可包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑。 一般而言，利用加壓空氣或注射泵將鞘液引入流式細(xì)胞儀的管口。優(yōu)選的加壓空氣為二氧 化碳或氮?dú)?，更?yōu)選二氧化碳。備選地，加壓空氣也可為氮?dú)狻?br>[0066] 樣品液或鞘液中也可任選包含添加劑，如上文"細(xì)胞樣品的收集"中討論過(guò)的抗生 素、調(diào)節(jié)胞內(nèi)和/或胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物或生長(zhǎng)因子。據(jù)此，將這些添加劑中的每 一種加入任一種液體中。
[0067] 備選地，可利用激光控制進(jìn)行精子分散體系中細(xì)胞的分選或富集。這也常稱為光 學(xué)捕獲或全息光學(xué)捕獲。一般而言，高度聚焦的激光（例如通過(guò)顯微透鏡聚焦的光）具有 大的強(qiáng)度梯度。光學(xué)捕獲根據(jù)光束的介電常數(shù)，利用一束光的梯度力來(lái)捕獲粒子。為使其 能量最低，介電常數(shù)大于周圍介質(zhì)的粒子會(huì)移動(dòng)到電場(chǎng)最高的光阱區(qū)域。此類裝置和方法 描述于如WO 2004/012133、美國(guó)專利號(hào)6, 416, 190及相關(guān)申請(qǐng)和專利，其每一篇內(nèi)容均在 此處引用作為參考。根據(jù)這些方法分選或富集出的精子細(xì)胞的不動(dòng)性使其易于在流動(dòng)中排 列，也便于激光控制細(xì)胞，從而能更有效和準(zhǔn)確地分選或富集所需細(xì)胞。
[0068] 因此，可將精子分散體系中的細(xì)胞分選為分離的群體，其中所述群體的精子包含 一定百分比帶有X染色體或帶有Y染色體的精子細(xì)胞。例如，某一群體的精子可包含至少 約65 %帶有X染色體或Y染色體的精子細(xì)胞，至少約70 %帶有X染色體或Y染色體的精子 細(xì)胞，至少約75%帶有X染色體或Y染色體的精子細(xì)胞，至少約80%帶有X染色體或Y染 色體的精子細(xì)胞，至少約85 %帶有X染色體或Y染色體的精子細(xì)胞，至少約90 %帶有X染 色體或Y染色體的精子細(xì)胞，或甚至至少約95%帶有X染色體或Y染色體的精子細(xì)胞。
[0069] (iii)分選細(xì)胞的收集
[0070] -旦完成分選，將分選細(xì)胞收集于包含收集液的容器中。一般而言，使用收集液的 目的包括提供細(xì)胞的液體支持。
[0071] 在一個(gè)實(shí)施方案中，收集液中可包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑。收集液中也可任選包含固醇、 脂質(zhì)、脂肪酸或蛋白質(zhì)源。若含納于收集液內(nèi)，則固醇、脂質(zhì)和脂肪酸可為如膽固醇。
[0072] 若收集液包含蛋白質(zhì)源，則其可為任何不會(huì)干擾精子細(xì)胞存活力并與所用的運(yùn)動(dòng) 性抑制劑相容的蛋白質(zhì)源。常用蛋白質(zhì)源的實(shí)例包括乳（包括熱勻漿和脫脂乳）、乳提取 物、卵黃、卵黃提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此類蛋白質(zhì)的使用濃度可為約1% (v/ V)至約 30% (v/v)，優(yōu)選約 10% (v/v)至約 20% (v/v)，更優(yōu)選約 10% (v/v)。
[0073] 任選地，收集液中也可含添加劑，如上文"細(xì)胞樣品的收集"中討論過(guò)的抗生素、生 長(zhǎng)因子或調(diào)節(jié)胞內(nèi)和/或胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。據(jù)此，將這些添加劑中的每一種 加入收集液中。
[0074] 因此，在某一實(shí)施方案中，收集液為包含0. 097摩爾/升NaHC03、0. 173摩爾/升 KHC03、0. 090摩爾/升C6H8O7 · H2O以及10% (v/v)卵黃的水溶液，pH為約6. 2,更優(yōu)選pH 為約7. 0,甚至更優(yōu)選為約6. 5。優(yōu)選將收集液保存在富集的二氧化碳分壓高于空氣的氣氛 中；例如，該氣氛中二氧化碳分壓可大于〇. 9,進(jìn)一步優(yōu)選0. 95,更優(yōu)選0. 99。
[0075] 可將分選細(xì)胞收集至包含或包被有冷凍伸展劑的容器中，以代替更常規(guī)的收 集液的使用。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，分選細(xì)胞收集于包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑的冷凍 伸展劑中。在另一實(shí)施方案中，分選的細(xì)胞收集于包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyi? (Minitube，Verona，WI，每升包含 60ml 甘油、24. 2g tris、13. 8g 梓檬酸、10.0 g 果糖、泰樂(lè) 菌素5mg/100ml、慶大霉素25mg/100ml、壯觀霉素30mg/100ml及林可霉素15mg/100ml)、 卵黃，以及任選丙酮酸鹽。在另一實(shí)施方案中，收集液為包含0. 097摩爾/升NaHC03、 0· 173摩爾/升KHC〇3、0. 090摩爾/升C6H8O7 · H2O水溶液的冷凍伸展劑，且每75ml水中含 25g Triladyi'?、25g卵黃和IOmM丙酮酸鹽。在另一實(shí)施方案中，收集液為包含0.097摩 爾/升NaHCO3、0. 173摩爾/升KHCO3、0. 090摩爾/升C6H8O7 · H2O水溶液的冷凍伸展劑，且 每 75ml 水中含 25g Triladyi?、25g 卵黃。
[0076] (iv)分選細(xì)胞的冷凍伸展
[0077] -旦完成精子的分選并收集其至收集容器內(nèi)，這些精子即可用于對(duì)雌性哺乳動(dòng)物 授精。這幾乎不需要對(duì)精子進(jìn)行其他處理就可以立即進(jìn)行。在這種情況下，可以將精子以 其現(xiàn)狀貯存于一段必要時(shí)間，以例如將精子運(yùn)輸?shù)竭M(jìn)行授精的地點(diǎn)。因此，可于如收集液中 貯存并運(yùn)輸精子。同理，可將精子于運(yùn)動(dòng)性抑制劑中濃縮至適合某具體哺乳動(dòng)物種系的密 度，例如密度為約50X IO6精子/ml至約120X 10 6精子/ml，隨后貯存并運(yùn)輸。選擇的濃度 取決于如下文"受精"中所討論的那些，其包括獲取細(xì)胞的哺乳動(dòng)物種系。這種基于獲得精 子的哺乳動(dòng)物種系的一系列密度為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。如下文詳細(xì)所述，在任何情況 下，貯存或運(yùn)輸期間的精子都保持不運(yùn)動(dòng)。
[0078] 同樣，也可以將精子冷卻或冷凍以備后用。在這種情況下，加入冷凍伸展劑以最大 程度地降低冷卻或冷凍對(duì)存活力或解凍后運(yùn)動(dòng)性的影響，對(duì)精子有益。
[0079] 運(yùn)動(dòng)性抑制劑可用于使冷凍伸展劑中的細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)。一般而言，冷凍伸展劑包含 運(yùn)動(dòng)性抑制劑、蛋白質(zhì)源和冷凍保護(hù)劑。若包含，也可加入蛋白質(zhì)源以提供細(xì)胞支持。蛋白 質(zhì)源可為不會(huì)干擾精子細(xì)胞存活力并與運(yùn)動(dòng)性抑制劑相容的任何蛋白質(zhì)源。常用蛋白質(zhì)源 的實(shí)例包括乳（包括熱勻漿和脫脂乳）、乳提取物、卵黃、卵黃提取物、大豆蛋白和大豆蛋白 提取物。此類蛋白質(zhì)的使用濃度可為約10% (v/v)至約30% (v/v)，優(yōu)選約10% (v/v)至 約 20 % (v/v)，更優(yōu)選約 20 % (v/v)。
[0080] 冷凍伸展劑中優(yōu)選包含冷凍保護(hù)劑，以減輕或避免冷凍休克或以保持精子的生育 力。本領(lǐng)域已知眾多冷凍保護(hù)劑。適于與給定伸展劑共同使用的冷凍保護(hù)劑可有多種選 擇，取決于待冷凍的精子來(lái)源于哪一種系。合適的冷凍保護(hù)劑的實(shí)例包括如，甘油、二甲基 亞砜、乙二醇、丙二醇、海藻糖、1>1丨3(^丨_$及其組合。若包含冷凍保護(hù)劑，則其在冷凍伸展 劑中的量一般為約1% (v/v)至約15% (v/v)，優(yōu)選其量為約5% (v/v)至約10% (v/v)， 更優(yōu)選其量為約7% (v/v)，最優(yōu)選量為約6% (v/v)。
[0081] 在具體實(shí)施方案中，冷凍伸展劑包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyi'?、卵黃和任選 丙酮酸鹽。而在另一實(shí)施方案中，冷凍伸展劑為含0. 097摩爾/升NaHC03、0. 173摩爾/升 khco3、o. 090 摩爾 / 升 C6H8O7 · H2O 的水溶液，且每 75ml 水中含 25g Triladyi?、25g 卵黃 和IOmM丙酮酸鹽。
[0082] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，冷凍伸展劑包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyl?和卵 黃。在另一實(shí)施方案中，冷凍伸展劑為含0.097摩爾/升NaHC03、0. 173摩爾/升KHC03、 0. 090摩爾/升C6H8O7 · H2O的水溶液，且每75ml水中含25g Triladyl?及25g卵黃。
[0083] 任選地，冷凍伸展劑中也可包含如上文"細(xì)胞樣品的收集"中討論過(guò)的抗生素、生 長(zhǎng)因子或調(diào)節(jié)胞內(nèi)和/或胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。據(jù)此，將這些添加劑中的每一種 加入收集液中。
[0084] II.收集細(xì)胞的貯存
[0085] A.貯存時(shí)間
[0086] -旦從來(lái)源哺乳動(dòng)物中收集細(xì)胞（不論其此后是否任選進(jìn)行分選），細(xì)胞都將貯 存一段時(shí)間。貯存時(shí)間取決于若干因素，包括如貯存細(xì)胞時(shí)的溫度、貯存容器內(nèi)的細(xì)胞數(shù) 目、細(xì)胞為分選的還是未分選的、細(xì)胞將用于授精的方法以及受精的雌性哺乳動(dòng)物。例如， 一般而言，貯存細(xì)胞數(shù)小時(shí)，如2、4、8、12或24小時(shí)；數(shù)日，如1、2、3、4、5、6或7日；數(shù)周，1、 2、3或4周；或數(shù)月，如1、2或3個(gè)月。一般而言，可于約5°C至約30°C溫度下貯存細(xì)胞數(shù) 小時(shí)至數(shù)天；可于約一 4°C至約5°C溫度下貯存細(xì)胞數(shù)日至數(shù)周；可于約一 190°C (于液氮 蒸汽中）至約一 4°C溫度下貯存細(xì)胞數(shù)周至數(shù)月。
[0087] B.貯存溫度
[0088] 細(xì)胞可貯存于一系列不同的溫度下。貯存溫度的選擇取決于若干因素，例如細(xì)胞 將貯存的時(shí)間的長(zhǎng)度、貯存容器內(nèi)的細(xì)胞濃度、細(xì)胞為分選還